本发明涉及结核分枝杆菌的发酵方法，属于生物发酵领域。本发明提供了一种全新的结核分枝杆菌发酵方法，通过菌株的一级扩增、二级扩增、一级发酵、二级发酵最终实现了结核分枝杆菌菌浓超高、目的蛋白大量表达的结果。获得全新的结核分枝杆菌的发酵方法，发酵收率不低于12g/L，而且菌体中总的rTPA38目的蛋白可达15%以上，活性也较高，这些都是现有技术无法达到的。菌体发酵的批量大，一次性可发酵10L至200L，收菌速度快，生产效率高。