本发明公开了一种白顶溪鸲线粒体控制区扩增嵌套引物及扩增、克隆和测序方法，属于生物技术领域，本发明采用6组扩增嵌套引物对白顶溪鸲线粒体控制区进行2次PCR扩增，第一轮PCR的产物可直接进行测序，第二轮PCR扩增出的片段结合琼脂糖凝胶回收纯化快速克隆技术可以大大提高测序模板的纯度和浓度，以消除测序过程中的异质性，有效攻克了多聚核苷酸序列导致测序失败的难题，直接测序结合克隆测序大大减轻了操作者的工作负担，本发明采用扩增嵌套引物二级结构少，构象稳定，6种嵌套引物的3’末端均避免了A碱基的引入从而大大降低非特异性扩增的风险。