本发明公开了一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，该方法包括花药愈伤组织诱导培养、愈伤组织分化培养、丛生芽生根培养、组培苗壮苗培养基、炼苗、染色体加倍和移栽、倍性鉴定和利用分子标记检测病毒的脱毒率等步骤，在进行组织培养过程中采用特定的培养基，特定的培养基为在常规培养基配方上利用以海藻糖代替蔗糖并添加黑果枸杞汁过滤液营养成分配制出来的培养基，培养完成后采用利用分子标记技术进行脱毒鉴定。本发明显著提高脱毒率，操作简单，成本低，花培苗移栽后成活率高，抗逆性强，易于推广，可以直接应用于生产，有较好的经济效益和社会效益。