本发明涉及单细胞检测领域，具体而言，涉及一种细胞内pH值(pHi)检测方法。所述方法包括：1).将被检细胞与细胞膜通透的、pH敏感性的荧光染料共孵育，将荷载有所述荧光染料的所述待检细胞置于控气、控温设备中的缓冲液中，在灌流/给药系统的辅助下，使用能够实时监测细胞荧光变化的装置记录不同处理对应的细胞荧光强度数据；2).使用不同已知pH的校准液处理细胞，建立细胞荧光强度‑细胞pHi相关数据的标准曲线，将所述细胞荧光强度数据代入所述标准曲线中，得到单细胞pHi。该方法在不损伤细胞的情况下可长时间、实时地监控单个或者多个细胞pHi的变化，并且可重复性好，适用于各种大小细胞的pH的检测。