本发明提供了一种从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离纯化天然蛋白酶3的方法，步骤包括：使用从人体输血后废弃医疗用品中回收并提取的中性粒细胞嗜天青颗粒,经研磨，溶解，离心后获得含有蛋白酶3的层析过柱起始蛋白溶液，结合阳离子交换层析柱，染色配体层析柱，分子筛层析柱以及亲和层析柱等纯化方法从人体血液中性粒细胞嗜天青颗粒中分离、纯化天然蛋白酶3。采用上述方法制备得到的天然蛋白酶3在产量、纯度、活性、特异性以及稳定性上均有大幅度的提高，其高质量更适用于科学研究以及医学检测。