本发明公开了一种孔雀石绿半抗原、人工抗原及其在荧光定量免疫层析中的应用，半抗原结构中同时具有两个孔雀石绿分子的结构，使得半抗原在载体蛋白中的空间位置更加突出，增加了识别位点，有效的提高了小分子半抗原的免疫原性，也提高了人工抗原的效价，将孔雀石绿人工抗原结合ELISA检测技术，对孔雀石绿的最低检测限为0.04μg/L；使用本发明中的人工抗原制备的荧光定量免疫层析试纸条配合本发明中的检测方法，可快速、便捷地实现孔雀石绿的检测，检测灵敏度可达0.2μg/L。