本发明涉及一种测定奶粉中维生素A,D,E的方法，包括以下步骤：将奶粉样品混匀，称取适量，加入水、无水乙醇、抗坏血酸、BHT及KOH水溶液，加热皂化，皂化完成后冷却定容；采用配有双阀三泵系统的高效液相色谱仪测定溶液中维生素A,D,E的含量；通过比较一维液相色谱中样品及标准物质的保留时间，确认样品中是否含有维生素A,E；通过比较二维液相色谱中样品及标准物质的保留时间，确认样品中是否含有维生素D；最后根据所得的维生素A,D,E的量，换算后计算样品中维生素A,D,E的含量；本发明简化了操作步骤，大大缩短前处理时间，节省人力和试剂成本，实现自动在线净化检测，提高灵敏度，保证了测试结果的准确性和再现性。