本发明涉及一种糖基亲水磁性复合物微球的制备方法及其应用，可有效解决糖蛋白分离富集效率低、种类少、操作繁琐、选择性与富集容量较低的问题，技术方案是首先采用溶剂热合成制备纳米四氧化三铁为磁性核心；然后对磁球表面进行双键功能化，使其表面修饰活性双键基团；再以氨基葡萄糖与丙烯酰氯为原料制备双键修饰葡萄糖，以其作为后续聚合反应的功能单体；最后采用蒸馏沉淀聚合反应，以双键修饰葡萄糖为单体，于磁球表面形成糖基亲水复合物；本发明制备方法简单，成本较低，节能环保，反应条件温和，易于生产，能够高效高选择性的分离富集糖蛋白/糖肽，并可以应用于复杂生物样品中糖肽或糖蛋白的富集，经济和社会价值显著。