本发明提供了一种硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针的合成方法：首先采用水热还原法制备氨基保护的硅纳米粒子；然后采用搅拌还原法制备羧基保护的金纳米簇；最后将硅纳米粒子和金纳米簇进行自组装，合成比率荧光探针。本发明室温下自组装合成硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针，过程简单、易操作、条件温和、耗时短。本发明提供的硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针能够准确采用比率荧光方法检测利福平，将所述硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针用于检测人血清中的痕量利福平，结果表明其回收率为97.0%～103.5%，且相对标准差(RSDs)均低于4%。