本发明公开了一种用于外泌体单分子定位超分辨成像的重组质粒和细胞株及其应用，把具有光激活性质的荧光蛋白基因和外泌体膜上标志性CD63蛋白基因进行融合构建成重组质粒，通过脂质体介导的质粒转染技术转染Hela细胞，通过药物筛选获得能够稳定表达光激活荧光蛋白标记的外泌体的Hela细胞。借助于光激活荧光蛋白，进行分离纯化的外泌体以及细胞内CD63蛋白分布的单分子定位的超分辨成像研究。与传统显微镜相比，单分子定位的超分辨成像提供更好的空间分辨率，实现了有活性的外泌体单分子定位显微成像，同时也实现了细胞内CD63蛋白分布的单分子定位成像研究。