本发明公开了一种缩宫素[5‑Asp]杂质的精制方法，该精制方法包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将缩宫素[5‑Asp]杂质粗品溶液依次进行反相富集、反相转盐、反相纯化，即可；缩宫素[5‑Asp]杂质粗品溶液为固相合成的还原型缩宫素[5‑Asp]杂质粗品溶液经氧化后而得；高效液相反相色谱法的填料为超耐水填料。本发明运用了在线反相富集、反相转盐、反相纯化一步法制得多肽纯品，缩宫素[5‑Asp]杂质粗品溶液中杂质的去除率较高，优化了生产工艺，柱平衡阶段、上样富集阶段和转盐阶段的流动相为水溶液，环保无污染，流出的废液可直接进行污水处理并回收利用。