本发明公开了一种高CG片段与低CG含量的启动子联用构建高效表达载体的方法，所述方法选择含增强子且在转录起始位点上游CG含量＜50%的启动子为靶启动子；用所述靶启动子替换商业载体pEGFP‑C1上的外源基因表达框中CMV启动子，构建中间载体；在所述中间载体的外源基因表达框之前Ase I酶切位点插入1‑1.5kb的CG含量＞70%的CG片段U1，构建表达载体；所述表达载体经验证能使靶启动子表达框内的EGFP基因表达量持续稳定高效表达。本发明所述方法可以应用于抗体及蛋白药物的工业化生产领域或基因治疗，以提高生产效率，降低生产成本，或经进一步改进后应用于该领域。