本发明提供了一种吡咯-萘酰亚胺衍生物荧光探针及其制备方法和应用，其中所述吡咯-萘酰亚胺衍生物的化学结构式如下： ；制备方法为：将N-吗啉乙基-2，4-二甲基-5-甲酰基吡咯-3-甲酰胺和4-肼基-N-羟乙基萘酰亚胺溶解于有机溶剂中；所得溶液滴加乙酸作催化剂，然后在80℃下回流搅拌反应3-4h；然后冷却至室温，减压抽滤，所得固体残渣用乙醇清洗，得到所述吡咯-萘酰亚胺衍生物荧光探针。本发明的吡咯-萘酰亚胺衍生物荧光探针在生理条件下能选择性的与铜离子作用，溶液红色褪色，同时绿色荧光显著增强，特别是作为荧光探针在细胞溶酶体内铜离子的方便检测的应用。