本发明公开了一种快速培育多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的方法，包括如下步骤：首先，采用多能干细胞标记基因Oct4、Sox2、Nanog和Gdf3中的任意一种或几种作为标记基因，获得多能干细胞荧光标记的嵌合体斑马鱼；然后，采用灭活的红鲫精子激活所述的嵌合体斑马鱼卵子，再通过热休克抑制胚胎第一次卵裂，即获得所述的多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体。本发明的方法可以快速培育多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体，相较于传统通过测交再自交(需历经至少3代)得到纯合转基因斑马鱼的方法，本发明的操作更简单，更快速，成本更低，具有重要的科学价值。