本发明提供了一种弱阴离子层析介质及其制备方法和应用，属于离子交换层析技术领域。本发明提供的弱阴离子层析介质的制备方法包括如下步骤：将四氯乙烯和司班80溶解于液体石蜡中，得到油相；将烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯、N,N‑亚甲基双丙烯酰胺、致孔剂、pH值为7的缓冲液及引发剂混合，得到水相；将所述油相和水相混合，在保护气氛下进行共聚反应，得到弱阴离子层析介质。本发明所提供的制备方法得到的弱阴离子层析介质具有与介质修饰型填料相当的耐压性和色谱展宽行为，且离子交换量大，因而具有更高的吸附载量。