本发明公开了一种拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的纯化方法。本发明应用高效液相色谱与质谱联用技术对拟南芥抗性代谢物Arabidopsides的乙醇浸出液进行抗性代谢物Arabidopsides检测，再应用硅胶柱分离系统进行分离，即可得到所述抗性代谢物Arabidopsides。本发明应用硅胶柱分离系统、高效液相色谱与质谱联用技术结合的方法，最大限度的成功纯化得到了包括Arabidopside A、Arabidopside B和Arabidopside D在内的至少3种类型的Arabidopsides。该方法高效提取纯化得到了多种抗性代谢物Arabidopsides，且该方法简单易行、成本低，对植物在防御病虫害的改善与进步方面具有重要指导意义。