本发明公开了一种应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，包括亲和素标记的磁微粒、生物素标记的HBP抗体1、辣根过氧化物酶标记的HBP抗体2、HBP校准品、浓缩洗液和底物。本发明还公开了试剂盒的制备方法和测定方法。本发明新型免疫测定试剂盒用以体外定量测定人体液中的HBP，克服了传统酶免疫分析(EIA)法在操作方面的人为误差，并可通过定量客观反映HBP的存在，为临床诊断及疗效观察和预后判断提供更有力的实验诊断依据。本发明所提供的肝素结合蛋白测定方法特异性高，重复性好，检测灵敏度高，线性范围宽，自动化程度高，操作简便快速；与EIA法比较，具有快速、简便、准确、干扰小的优点。