本发明涉及分枝杆菌的鉴定方法。该分枝杆菌的鉴定方法包括如下步骤：采用引物组合物对待测样本进行基因检测，以对待测样本进行分枝杆菌鉴定，引物组合物包括非结核分枝杆菌检测引物对，非结核分枝杆菌检测引物对包括碱基序列如SEQ ID No.33‑SEQ ID No.277、如SEQ ID No.310‑SEQ ID No.554所示的引物。本申请通过使用多重PCR靶向捕获技术和高通量二代测序技术，提供了一种可以快速、准确、高效鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的引物组合及试剂盒，可以覆盖常见的9种结核分枝杆菌和49种非结核分枝杆菌，可以为临床诊断和用药提供更准确、更全面的参考。