公开(公告)号：KR100973823B1

公开(公告)日：2010-08-04

申请号：KR1020080008364

申请日：2008-01-28

Applicant: 고려대학교 산학협력단

Inventor： 최승철 ,  최지현 ,  임도선

IPC: C12N5/071 ,  C12N5/02 ,  C12N5/00

Abstract: 본 발명은 배아성 암종 세포를 기본배지 및 혈청을 포함하나 되먹임세포(feeder cell) 및 분화억제제가 첨가되지 않은 배양배지에서 배양하여 배상체를 형성하는 단계 및 상기 형성된 배상체에 혈관내피성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor)를 처리하여 혈관내피세포로 분화 유도하는 단계를 포함하는 배아성 암종 세포로부터 혈관내피세포로의 분화유도방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 배아성 암종 세포가 혈관내피세포로 분화능이 있음을 혈관내피세포 마커를 사용한 면역염색법, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)에 의한 혈관내피세포 마커들의 정량적 분석, 배양액 조성 및 우태아혈청 첨가 농도에 따른 혈관내피세포로의 분화율 비교, 유세포 분석을 통하여 정량적으로 입증하였으며, 이러한 결과를 토대로 배아성 암종 세포를 혈관내피세포로 분화시켜 혈관내피세포를 대량으로 배양할 수 있다. 배아성 암종 세포는 유전자 도입이 쉽고, 세포 배양이 용이하며, 저비용으로 대량 배양이 가능한 장점을 가지고 있기 때문에 본 발명에 따라 생산된 혈관세포를 이용하여 혈관내피세포로의 분화 기전 연구, 심혈관 및 뇌혈관질환의 치료 연구, 신생혈관 차단에 의한 항암제 개발 연구 등에 유용하게 이용할 수 있다.

公开(公告)号：KR1020090055964A

公开(公告)日：2009-06-03

申请号：KR1020070122869

申请日：2007-11-29

Applicant: 고려대학교 산학협력단

Inventor： 임도선 ,  최승철

IPC: C12N5/07

Abstract: A method for isolating a mesenchymal stem cell which is derived from a bone marrow is provided to isolate the mesenchymal stem cell of high purity using an isolation marker, Sca-1, and improve the cell therapy by differentiating to a cardiac myocyte, adipocyte, and osteocyte. A method for isolating a mesenchymal stem cell derived from a bone marrow comprises: a step of isolating a myelocyte from the bone marrow and attaching-culturing in a culture container; a step of treating a trypsin/ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA) solution into the myelocyte and attaching-culturing a myelocyte isolated by the trypsin/EDTA solution in another culture container; a step of reacting with a linker-conjugated Sca-1 antibody; a step of treating with an anti-linker magnetic bead; and a step of separating the myelocyte which is bonded with the anti-linker magnetic bead using a magnet-activated column.

Abstract translation: 提供了分离源自骨髓的间充质干细胞的方法，以使用分离标记Sca-1分离高纯度的间充质干细胞，并通过区分心肌细胞，脂肪细胞和 骨细胞。 用于分离源自骨髓的间充质干细胞的方法包括：从骨髓中分离骨髓细胞并在培养容器中附着培养的步骤; 将胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液处理到骨髓细胞中并将由胰蛋白酶/ EDTA溶液分离的骨髓细胞附着培养在另一培养容器中的步骤; 与接头偶联的Sca-1抗体反应的步骤; 用反接头磁珠处理的步骤; 以及使用磁激活柱分离与抗连接磁珠结合的骨髓细胞的步骤。

公开(公告)号：KR1020090055953A

公开(公告)日：2009-06-03

申请号：KR1020070122850

申请日：2007-11-29

Applicant: 고려대학교 산학협력단

Inventor： 임도선 ,  최승철

IPC: C12N15/64 ,  C12N15/09 ,  C12Q1/68

CPC classification number: C12N15/63 ,  C12Q1/6816 ,  C12Q1/6897

Abstract: A recombinant expression vector for monitoring the differentiation of stem cell to a cardiomyogenic cell is provided to detect the differentiation and use for cell therapy of cardiovascular disease and stability and efficiency of stem cell therapy. A recombinant expression vector pDsRed-Express-1/mMLC, pDsRed-Express-1/rMLC, pEGFP-1/cTn-1, or pDsRed-Express-1/cTn-1 for monitoring the differentiation to a cardiomyogenic cell comprises a promoter inducing the cardiomyogenic cell-specific expression and reporter gene which is operably linked. The promoter inducing the cardiomyogenic cell-specific expression is the promoter myosin light chain 2v promoter of the sequence number 1(SEQ ID NO:1), rat myosin light chain 2v promoter of the sequence number 2, or myocardial troponin I promoter of the sequence number 3. A method for monitoring the differentiation to cardiomyogenic cell comprises: a step of preparing a mesenchymal stem cell; a step of transducing the recombinant expression vector into a prepared stem cell; and a step of confirming the expression of reporter gene in the transduced stem cell.

Abstract translation: 提供了一种用于监测干细胞向致心肌细胞分化的重组表达载体，用于检测心血管疾病细胞治疗的分化和用途以及干细胞治疗的稳定性和效率。 用于监测分化成心肌细胞的重组表达载体pDsRed-Express-1 / mMLC，pDsRed-Express-1 / rMLC，pEGFP-1 / cTn-1或pDsRed-Express-1 / cTn-1包含启动子诱导 心肌细胞特异性表达和可操作地连接的报告基因。 诱导心肌细胞特异性表达的启动子是序列号1（SEQ ID NO：1），序列号2的大鼠肌球蛋白轻链2v启动子或序列的心肌肌钙蛋白I启动子的启动子肌球蛋白轻链2v启动子 3.一种监测分化成心肌细胞的方法，包括：制备间充质干细胞的步骤; 将重组表达载体转导到制备的干细胞中的步骤; 以及确认转录干细胞中报道基因表达的步骤。

公开(公告)号：KR1020090055869A

公开(公告)日：2009-06-03

申请号：KR1020070122718

申请日：2007-11-29

Applicant: 고려대학교 산학협력단

Inventor： 최승철 ,  임도선

IPC: C12N15/64 ,  C12N15/09 ,  C12Q1/68

CPC classification number: C12N15/63 ,  C12Q1/6816 ,  C12Q1/6897

Abstract: A recombinant expression vector for monitoring the differentiation of a cardiomyogenic cell and endothelial cell is provided to detect the cell differentiation after cell therapy and verify the stability. A recombinant expression vector pMLC-2v-DsRed-Flk-1-EGFP or pMLC-2v-DsRed-Tie-2-EGFP for monitoring the differentiation of a cardiomyogenic cell and endothelial cell comprises a promoter which induces the cardiomyogenic cell-specific expression; a first reporter gene which is connected to be operatable; a promoter which induces the endothelial cell-specific expression; and a second reporter gene which is connected to be operatable. The promoter which induces cardiomyogenic cell-specific expression is the myosin light chain 2v promoter of the sequence number 1(SEQ ID NO:1), rat myosin light chain 2v promoter of the sequence number 2, or myocardium troponin I promoter of the sequence number 3. The endothelial cell-specific promoter is the Flk-1 promoter of the sequence number 4 and Tie-2 promoter of the sequence number 5. A method for monitoring the differentiation of cardiomyogenic cell and endothelial cell at once: a step of preparing a mesenchymal stem cell; a step of inducing the recombinant expression vector for monitoring the differentiation of cardiomyogenic cell and endothelial cell into the mesenchymal stem cell; and a step of confirming the expression of reporter gene in a transformed mesenchymal stem cell.

Abstract translation: 提供用于监测心肌细胞和内皮细胞分化的重组表达载体以检测细胞治疗后的细胞分化并验证稳定性。 用于监测心肌发生细胞和内皮细胞分化的重组表达载体pMLC-2v-DsRed-Flk-1-EGFP或pMLC-2v-DsRed-Tie-2-EGFP包含诱导心肌细胞特异性表达的启动子; 连接到可操作的第一报告基因; 诱导内皮细胞特异性表达的启动子; 和连接成可操作的第二报道基因。 引起心肌发生细胞特异性表达的启动子是序列号1（SEQ ID NO：1）的肌球蛋白轻链2v启动子，序列号2的大鼠肌球蛋白轻链2v启动子或序列号的心肌肌钙蛋白I启动子 3.内皮细胞特异性启动子是序列号为4的Flk-1启动子和序列号5的Tie-2启动子。一种用于一次性监测心肌细胞和内皮细胞分化的方法： 间充质干细胞 诱导重组表达载体监测心肌细胞和内皮细胞分化为间充质干细胞的步骤; 以及确认报道基因在转化的间充质干细胞中的表达的步骤。

公开(公告)号：KR100952368B1

公开(公告)日：2010-04-09

申请号：KR1020070122718

申请日：2007-11-29

Applicant: 고려대학교 산학협력단

Inventor： 최승철 ,  임도선

IPC: C12N15/64 ,  C12N15/09 ,  C12Q1/68

Abstract: 본 발명은 심근세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 제1 리포터 유전자, 그리고 혈관내피세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 제2 리포터 유전자를 함께 포함하는 심근세포 및 혈관내피세포 분화 모니터링용 재조합 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 심근 및 혈관내피세포로의 분화능을 가지고 있어 심혈관질환의 유전자 및 세포 치료 연구에 널리 이용되고 있는 중간엽 줄기세포내로 심근 또는 혈관내피세포 프로모터의 활성을 동시에 모니터링할 수 있는 이중 프로모터 기반 리포터유전자 발현벡터들을 도입한 후 심근세포 분화의 특이적인 모니터링을 하여 심혈관질환의 세포치료 후 이식된 세포의 분화 탐지 및 안전성 검증에 크게 기여할 수 있고, 더 나아가 심근 및 혈관내피세포 특이적인 발현이 확인된 본 발명의 프로모터 영역에 양전자 방사 단층 X선 사진법(PET) 또는 자기공명영상(MRI) 표지자들을 부착하여 생체내로 이식된 줄기세포의 심근 및 혈관내피세포로의 분화 추적 연구에 응용할 수 있어 심혈관질환의 줄기세포 치료 효능 및 안전성 확보에 크게 기여할 수 있다.

公开(公告)号：KR100952365B1

公开(公告)日：2010-04-09

申请号：KR1020070122850

申请日：2007-11-29

Applicant: 고려대학교 산학협력단

Inventor： 임도선 ,  최승철

IPC: C12N15/64 ,  C12N15/09 ,  C12Q1/68

Abstract: 본 발명은 줄기세포에서 심근세포로의 분화 모니터링을 위한 재조합 발현벡터에 관한 것으로, 구체적으로 심근세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 심근세포로의 분화 모니터링용 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 심근세포로의 분화 모니터링 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 줄기세포가 심근세포계통으로 분화되었는가를 탐지할 수 있는 심근세포 특이 프로모터 서열에 리포터유전자가 부착된 발현벡터들을 구축할 수 있으며, 구축된 발현벡터를 줄기세포로 도입한 후 5-아자시티딘 처리에 의해 심근세포로 분화를 유도하고, 이어 리포터유전자의 발현이 심근세포로 분화된 세포에서만 발현되어짐을 면역염색법에 의해 입증함으로써, 줄기세포가 심근세포계통으로 분화되었는가를 탐지할 수 있음을 확인하였다.