本发明公开了一种结核分枝杆菌利福平耐药突变可视化检测探针及其应用。本发明针对利福平耐药突变，根据结核分枝杆菌利福平耐药的rpoB基因突变核心区所包含的突变位点设计合成检测探针簇，包括：共有的锚定探针A、绝缘探针L和R、突变检测探针B和共有的竞争探针SIB，探针B与和探针SIB具有相同的靶DNA互补区，仅突变位点的碱基种类不同。具体探针簇包含9个探针组，每个探针组含一种特定的突变检测探针B，此法设计的各探针组和探针簇对合成的野生型和突变型检测片段有良好的区分性，并能准确检测利福平耐药结核分枝杆菌rpoB基因525-529位氨基酸具体的突变位点，具有良好的应用前景。