本发明涉及分离技术领域，公开了一种聚乙烯亚胺超支化琼脂糖基硼亲和材料的制备方法及其应用，制备方法包括：1)琼脂糖微球的制备；2）环氧化琼脂糖的制备；3）环氧化琼脂糖的氨基化修饰；4）苯硼酸琼脂糖的制备。本发明制备的基于琼脂糖基的高柱容量高生物相容性硼亲和材料，其中琼脂糖被选作为基架，聚乙烯亚胺作为超支化配基进行修饰，同时3,5‑二氟‑4‑甲酰基苯硼酸作为亲和基团；琼脂糖具有更高的亲和性及柱容量和可操作性。本发明克服了一系列技术问题，成功将硼亲和材料应用于细胞水平的识别与分离，与现有技术相比，取得了显著的进步。