本发明公开了一种能够稳定表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的BHK-21细胞系建立方法，该鸭坦布苏病毒株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏名称为鸭黄病毒AH-F10株，保藏编号为：CCTCC V201213；构建方法如下：1)重组质粒pLOV-eGFP-NS1的构建；2)慢病毒样颗粒的制备；3)表达NS1细胞系的构建与筛选；4)NS1基因转录和核酸检测；5)NS1蛋白表达水平的检测。本发明可以获得在细胞外表达的具有生物活性构象的分泌表达的可溶性的鸭坦布苏病毒NS1蛋白。表达NS1细胞系筛选中我们以10μg/mL的嘌呤霉素培养液进行筛选，传代5次后即可检测到NS1基因的表达，第十代NS1细胞系就可以稳定表达，能够稳定表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的BHK-21细胞系方法比传统细胞系方法的时间缩短2/3。