本发明公开了一种CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体及其构建方法和应用，包括pCambia1300-RfxCas13d重组载体，构成如下：CaMV 35S启动子，潮霉素基因，CaMV poly(A)信号终止子，pVS1 RepA，pVS1复制起点，CaMV 35S启动子，RfxCas13d基因，NOS终止子；其中，RfxCas13d基因序列如SEQ ID No.1所示，NOS终止子序列如SEQ ID No.2所示。本发明利用带有GFP荧光标签的芜菁花叶病毒(TuMV-GFP)侵染性克隆来指示RNA病毒自然侵害植物，利用RfxCas13d蛋白和sgRNA结合可以定向特定位置切割RNA。本发明构建的载体能够有效抑制TuMV的侵染，为植物病毒病的防控提供新的策略，具有重要的生产意义。