本发明公开了一种酶催化的蛋白质C‑端选择性酰肼化修饰方法。本发明提供了一种对蛋白质C端进行酰肼化修饰的方法，包括：在待修饰蛋白C末端连一个甘氨酸，经酶1(SEQ ID No.1)催化使其C末端酰胺化，经酶2(SEQ ID No.2)催化与亲核有机胺反应，从而完成对待修饰蛋白质的C端的酰肼化修饰。利用该方法可实现对蛋白质C端的酰肼化修饰，且为水相反应，条件温和，C‑末端选择性修饰，不影响侧链其他修饰基团，侧链无需保护，底物谱广，无底物蛋白质氨基酸序列限制。