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    감염력이 있는 구제역바이러스 Ｏ형 ｃＤＮＡ 클론 및 클론의 전체염기서열
    16.
    发明授权
    감염력이 있는 구제역바이러스 Ｏ형 ｃＤＮＡ 클론 및 클론의 전체염기서열 有权
    O型口蹄疫病毒的传染性cDNA克隆和克隆的完整序列

    公开(公告)号：KR101384513B1

    公开(公告)日：2014-04-14

    申请号：KR1020110147110

    申请日：2011-12-30

    Applicant: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)

    Inventor： 이광녕 ,  김수미 ,  박종현 ,  고영준 ,  이향심 ,  조인수 ,  이서용

    IPC: C12N15/33 ,  C12N15/86

    Abstract: 본 발명은 구제역의 7가지 혈청형(O, A, Asia 1, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3)중에서, O형 PanAsia 계통에 속하는 2002년 국내 발생한 구제역바이러스(O/SKR/2002)의 전체 RNA 게놈을 double strand DNA형태로 증폭하여 벡터에 삽입한 클론들과 그 서열에 관한 것으로서, 이들 클론은 linear DNA형태로 혹은 in vitro transcribed RNA 형태로 특정 세포에 형질도입(Transfection)시켰을 경우에 감염력이 있는 구제역바이러스를 생성하거나 구제역바이러스 단백질을 생산할 수 있도록 최종 선발된 것들이다.
    본 발명은 구제역 병원성 확인 연구나 백신 및 진단법 개발의 효과적인 연구 수단으로 폭 넓게 활용될 수 있는 구제역바이러스 cDNA 클론을 작성한 것으로, 클론 작성의 대상이 되는 구제역바이러스는 2002년 국내 양돈농가에서 사육중이던 돼지에서 발생되어 보고된 구제역바이러스 국내분리주 및 임상시료내 바이러스이다. 이 바이러스는 1990년대 초반부터 아시아에서 발생하기 시작하여 현재까지 전 세계적으로 가장 널리 전파된 혈청형 O형의 PanAsia 계통으로 분류되고 있으며, 본 발명에서 이 계통의 바이러스로는 최초로 감염력이 있는 cDNA 형태로 클로닝되었다.
    먼저 감염력있는 클론 작성을 위해 돼지유래세포(IB-RS-2)에서 3회 이상 계대증식된 바이러스의 게놈 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 뒤, 전체 게놈을 네 부위로 나누어 증폭시키고 그 각각을 별개의 벡터에 클로닝 하였다. 이렇게 작성된 클론들을 하나의 벡터로 클로닝하여 연결한 뒤, 클로닝 과정에서 임의로 생성된 비의도적 돌연변이를 site-directed mutagenesis를 통하여 원래의 서열과 동일하도록 교정해 주었다. 한편, 분리주 유래의 cDNA 클론에 돼지 및 소 임상시료내 바이러스(야외주) 염기서열을 반영하기 위한 게놈부위(genomic region) 치환 작업을 광범위하게 실시하였다. 이러한 클론들의 세포실험 또는 동물실험을 통해서 우리는 구제역 cDNA클론의 감염성 획득여부에 결정적인 역할을 하는 두 게놈 부위 (poly(C) 및 VP1)를 확인하였고, 이 두 부위에 대한 적절한 유전적 조작(mutagenesis)를 통해서 감염력이 있는 cDNA클론을 최종적으로 선발할 수 있었다. 아울러 감염력은 확인되지 않으나 복제능이 있고 구제역바이러스 단백질을 생산하는 비감염성 cDNA클론도 선발하였다.
    특히, VP1 단백질을 번역하는 게놈부위 특정 위치(Residue)의 아미노산서열이 페닐알라닌(Phenylalanine)이 아닌 cDNA클론의 경우, 이 클론은 DNA 혹은 RNA 형태로 세포에 형질도입(Transfection)된 후의 바이러스 생성과정에서 해당 위치의 아미노산서열이 페닐알라닌(Phenylalanine)으로 선택(Selection)되어 치환(Substitution)되는 현상이 지속적으로 확인되었다. 이러한 특정위치의 염기서열(아미노산서열)의 변화는 바이러스가 획득될 때 나타내는 세포변성효과(Cytopathic effect, CPE) 등과 더불어 바이러스 획득여부를 판가름할 수 있는 중요한 지표로 활용될 수 있으며, 바이러스의 침입, 감염 및 진화연구와 바이러스억제제 개발의 소재로도 활용될 수 있다.

    감염력이 있는 구제역바이러스 Ｏ형 ｃＤＮＡ 클론 및 클론의 전체염기서열
    17.
    发明公开
    감염력이 있는 구제역바이러스 Ｏ형 ｃＤＮＡ 클론 및 클론의 전체염기서열 有权
    O型卵巢病毒感染性CDNA克隆和克隆的完整序列

    公开(公告)号：KR1020130078265A

    公开(公告)日：2013-07-10

    申请号：KR1020110147110

    申请日：2011-12-30

    Applicant: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)

    Inventor： 이광녕 ,  김수미 ,  박종현 ,  고영준 ,  이향심 ,  조인수 ,  이서용

    IPC: C12N15/33 ,  C12N15/86

    Abstract: PURPOSE: A cDNA clone is provided to acquire basic knowledge related to replication, expression, and infection of foot-and-mouth disease virus, and to be used vaccine and diagnostic materials, thereby resolving problems of existing inactivated vaccines. CONSTITUTION: A cDNA clone is prepared using foot-and-mouth disease virus with a base sequence of sequence number 1. The clone is prepared using foot-and-mouth disease virus with a base sequence selected from a group consisted of base sequences of sequence numbers 2, 3, 4, and 5. The clone identifies replication and expression difference of a replicon by manipulating untranslated region (UTR) or T7 promoter site of the clone with a base sequence of sequence number 5. In the clone, G is added at 644nt G and C is substituted with T at 9602nt in T7 promoter. A replicon clone has a base sequence of sequence number 6. [Reference numerals] (AA,BB,CC) Foot-and-mouth disease; (DD) Prepare linear DNA (Nsi cut); (EE) Confirm RNA quantification & integrity; (FF) Confirm virus production; (HH) Acquire infectious foot-and-mouse disease virus or express a non-infectious foot-and-mouth virus-like particle and protein

    Abstract translation: 目的：提供cDNA克隆以获得与口蹄疫病毒的复制，表达和感染有关的基础知识，并使用疫苗和诊断材料，从而解决现有灭活疫苗的问题。 构成：使用具有序列号1的碱基序列的口蹄疫病毒制备cDNA克隆。使用口蹄疫病毒制备克隆，碱基序列选自由序列的碱基序列组成的组 编号2,3,4和5.克隆通过用序列号5的碱基序列操纵克隆的非翻译区（UTR）或T7启动子位点来鉴定复制子的复制和表达差异。在克隆中，加入G 在644nt G和C在T7启动子的9602nt被T替代。 复制子克隆具有序列号6的碱基序列。[附图标记]（AA，BB，CC）口蹄疫; （DD）制备线性DNA（Nsi切割）; （EE）确认RNA定量和完整性; （FF）确认病毒生产; （HH）获得感染性脚鼠病毒病毒或表达非感染性口蹄疫病毒样颗粒和蛋白质

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