公开(公告)号：WO2014185692A1

公开(公告)日：2014-11-20

申请号：PCT/KR2014/004276

申请日：2014-05-13

Applicant: 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단

Inventor： 이정원 ,  김성훈 ,  남서희 ,  김대규

IPC: G01N33/574 ,  C12Q1/68 ,  C12M1/34 ,  C12M3/00

CPC classification number: G01N33/573 ,  C12Q1/6886 ,  C12Q2600/112 ,  C12Q2600/136 ,  C12Q2600/158 ,  G01N33/5011 ,  G01N33/574 ,  G01N33/57419 ,  G01N2333/4704 ,  G01N2333/9015 ,  G01N2500/00 ,  G01N2500/04 ,  G01N2500/10

Abstract: 본 발명은 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 암 세포주에서 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS)의 작용을 분석하여 암 전이 억제제 스크리닝 및 암 세포의 암세포덩어리로부터의 이탈, 상피-중배엽세포 전이(epithelial- mesenchymal transition), 이동, 침윤 및 전이 모니터링 방법에 관한 것으로, 구체적으로 HCT116 세포주를 포함하여 다양한 대장암 세포를 이용하여 KRS를 발현하거나 발현하지 않도록 조절된 세포주나 회전타원체(spheroid) 덩어리 세포주를 제작하여 2차원적 환경에서 배양할 경우, KRS의 발현을 억제하는 세포주에서 불완전한 상피-중간엽세포 전이 표현형(incomplete epithelial-to-mesenchymal transition phenotype; incomplete ECM phenotype)이 유도되고, 이는 KRS의 발현 억제가 세포-세포외기질(extracellular matrix; ECM) 부착 및 세포-ECM 신호전달 활성을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 제작된 회전타원체(spheroid) 세포주를 수용성 환경 또는 3차원 콜라겐 겔 배양환경에서 배양한 경우, KRS의 발현 억제는 중간엽(mesenchymal) 세포로 세포를 유도하지만, 이는 세포-세포 부착의 와해로 연결되지는 못하며, 세포-ECM 부착 및 이와 관련된 신호활성을 억제함으로써 3차원 콜라겐 겔 배양환경에서 배양한 회전타원체(spheroid) 세포들로부터 이탈(dissemination)의 억제를 초래하고, 세포 미세환경 내에 존재하는 TGFβ1에 의한 세포의 이탈을 유도하지 못함을 확인함으로써 암 전이억제제 스크리닝 및 암 세포의 이동, 침윤 및 전이 모니터링 방법에 사용할 수 있고, 이는 약물 개발에 필요한 전임상 실험시 저비용 고효율의 부가가치를 창출할 수 있는 스크리닝 방법 중의 하나로 유용하게 사용될 것이다.

Abstract translation: 本发明涉及通过分析在三维胶原凝胶环境中培养的癌细胞系中赖氨酰-tRNA合成酶（KRS）的活性来检测癌症转移抑制剂的方法，以及监测癌细胞传播的方法 来自聚集的癌细胞，以及癌细胞的上皮 - 间质转化，迁移，侵袭和转移。 具体而言，通过使用包含HCT116细胞系的各种结肠直肠癌细胞，构建了将KRS调节为表达或未表达的细胞系或球状聚集细胞系，然后在 二维环境，在抑制KRS表达的细胞系中诱导不完全的上皮 - 间质转化表型（不完全的ECM表型），并且抑制KRS表达抑制细胞 - 细胞外基质（ECM）粘附和细胞 - ECM信号活性 。 此外，证实了在构建的球状细胞系在水溶性环境或三维拼贴凝胶培养环境中培养的情况下，KRS表达的抑制诱导细胞进入间充质细胞，但未能达到 细胞粘附分解; 抑制细胞 - ECM粘附和相关的信号传导活性，从而抑制细胞在三维胶原凝胶培养环境中培养的球状细胞的传播; 并且不能通过存在于细胞微环境中的TGF-β1诱导细胞的传播。 因此，本发明可以用作筛选癌症转移抑制剂的方法和用于监测癌细胞的迁移，侵袭，转移的方法，并且将作为能够产生低成本， 药物开发所需临床前试验时的有效附加值。

公开(公告)号：WO2014185661A1

公开(公告)日：2014-11-20

申请号：PCT/KR2014/004146

申请日：2014-05-09

Applicant: 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단

Inventor： 이정원 ,  김성훈 ,  이미숙

IPC: C12Q1/04 ,  C12N5/09 ,  C12M1/34

CPC classification number: G01N33/574 ,  C12N5/0693 ,  C12N2501/727 ,  C12N2503/02 ,  C12N2533/54 ,  G01N33/5011 ,  G01N33/5023 ,  G01N33/5026 ,  G01N33/5029 ,  G01N33/57415 ,  G01N2333/4703 ,  G01N2333/4704 ,  G01N2333/4706 ,  G01N2440/14 ,  G01N2500/10

Abstract: 본 발명은 3차원적 환경에서 배양된 암 세포의 모양관찰, 인바도포디아(invadopodia) 형성 및 전이에 관련된 단백질의 활성, 발현 및 발현위치 변화, 세포외기질의 분해 측정을 이용한 암 세포의 이동, 침윤 및 전이성 모니터링, 및 암 전이억제제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 세포에서 c-Jun 인산화의 감소가 snail1의 발현 증가 및 코르탁틴(cortactin) 발현 감소를 유발하였고, 이러한 단백질들간의 발현조절 관계는 환자로부터 수득한 유방암 세포조직에서도 동일함을 확인하였다. 또한, 3차원적 콜라겐 겔 환경 내의 유방암 세포에 JNK 억제제를 처리하였을 때, 세포의 모양이 길어지고, 세포 및 세포외 기질의 접촉부분이 밋밋해지고 가늘어지며, 암세포의 이동이 감소하고, 단백질 발현 변화에 있어서는 TGFβ1의 발현증가, smad2 및 smad3의 발현 및 활성 증가, snail1의 발현 증가 및 코르탁틴의 발현 감소 및 이에 따른 인바도포디아의 형성 저하를 확인하였다. 또한, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 코르탁틴외에도 MT1-MMP가 다른 인바도포디아 마커로 사용될 수 있고, 이는 JNK 억제가 코르탁틴의 발현을 감소시키고, snail1의 발현을 증가시키면서 동시에 MT1-MMP의 위치 및 역할에 부정적 영항을 미쳐 인바도포디아의 형성을 억제하며, 콜라겐 겔 기질의 분해능을 억제하는 것을 확인함으로써 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법 및 암 전이억제제의 스크리닝 방법으로 사용할 수 있고, 이는 약물 개발에 필요한 전임상 실험 시 저비용 고효율의 부가가치를 창출할 수 있는 스크리닝 방법 중의 하나로 유용하게 사용될 것이다.

Abstract translation: 本发明涉及通过观察在三维环境中培养的癌细胞的形状来监测癌细胞的迁移，侵袭和转移的方法，并且测量与侵入体形成相关的蛋白质的表达位点的活性，表达和变化 和转移，以及细胞外基质的降解; 涉及筛选癌症转移抑制剂的方法。 更具体地说，证实了c-Jun磷酸化的减少诱导了在三维环境中培养的细胞中蜗牛1的增加和皮质醇表达的降低，并且蛋白质之间的表达调节关系与乳腺癌中的相同 从患者获得的组织。 此外，证实当用JNK抑制剂处理三维胶原凝胶环境中的乳腺癌细胞时，细胞的形状变长; 细胞和细胞外基质的接触区域变平且变薄; 癌细胞迁移减少; 观察到蛋白质表达的变化，如TGF-bgr1表达增加，smad2和smad3表达和活性的增加，snail1表达的增加，cortactin表达的降低以及由此造成的invadopodia形成的减少。 另外，在三维胶原凝胶环境中，除了皮质激素外，MT1-MMP可以作为侵袭过程的标记，证实JNK的抑制作用导致皮质激素表达的降低和snail1表达的增加， 严重影响MT1-MMP的抑制形成侵袭性的位点和作用，抑制胶原凝胶底物的降解活性。 因此，本发明可以用作监测癌细胞的迁移，侵袭，转移和转移程度的方法和用于筛选癌症转移抑制剂的方法，并且将作为能够产生低分子量的筛选方法之一 - 药物开发所需的临床前试验时的高效附加值。

公开(公告)号：KR1020160083828A

公开(公告)日：2016-07-12

申请号：KR1020160080285

申请日：2016-06-27

Applicant: 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단

Inventor： 이정원 ,  김성훈 ,  이미숙

IPC: C12Q1/04 ,  G01N33/15 ,  C12Q1/00 ,  C12Q1/02

CPC classification number: C12Q1/04 ,  C12Q1/00 ,  C12Q1/02 ,  G01N33/15

Abstract: 본발명은 3차원적환경에서배양된암 세포의모양관찰, 인바도포디아(invadopodia) 형성및 전이에관련된단백질의활성, 발현및 발현위치변화, 세포외기질의분해측정을이용한암 세포의이동, 침윤및 전이성모니터링, 및암 전이억제제스크리닝방법에관한것으로, 보다구체적으로 3차원콜라겐겔 환경내에서배양된세포에서 c-Jun 인산화의감소가 snail1의발현증가및 코르탁틴(cortactin) 발현감소를유발하였고, 이러한단백질들간의발현조절관계는환자로부터수득한유방암세포조직에서도동일함을확인하였다. 또한, 3차원적콜라겐겔 환경내의유방암세포에 JNK 억제제를처리하였을때, 세포의모양이길어지고, 세포및 세포외기질의접촉부분이밋밋해지고가늘어지며, 암세포의이동이감소하고, 단백질발현변화에있어서는 TGFβ1의발현증가, smad2 및 smad3의발현및 활성증가, snail1의발현증가및 코르탁틴의발현감소및 이에따른인바도포디아의형성저하를확인하였다. 또한, 3차원콜라겐겔 환경에서코르탁틴외에도 MT1-MMP가다른인바도포디아마커로사용될수 있고, 이는 JNK 억제가코르탁틴의발현을감소시키고, snail1의발현을증가시키면서동시에 MT1-MMP의위치및 역할에부정적영항을미쳐인바도포디아의형성을억제하며, 콜라겐겔 기질의분해능을억제하는것을확인함으로써암 세포의이동, 침윤, 전이성및 전이정도를모니터링하는방법및 암전이억제제의스크리닝방법으로사용할수 있고, 이는약물개발에필요한전임상실험시 저비용고효율의부가가치를창출할수 있는스크리닝방법중의하나로유용하게사용될것이다.

Abstract translation: 本发明涉及使用在3D胶原凝胶环境中培养的细胞监测癌细胞转移的方法。 该方法包括以下步骤：1）通过在培养容器中使用3D培养环境培养癌细胞; 2）测量形状的变化，侵袭过程的形成和降解，运动的活动，渗透和转移相关蛋白，表达以及细胞外基质的表达位置或降解程度的变化 的培养的癌细胞。 本发明提供了监测癌细胞的运动，渗透，转移和转移程度的方法。

公开(公告)号：KR101593049B1

公开(公告)日：2016-02-12

申请号：KR1020140056973

申请日：2014-05-13

Applicant: 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단

Inventor： 이정원 ,  김성훈 ,  남서희 ,  김대규

IPC: C12Q1/02 ,  C12N5/09 ,  G01N33/15

CPC classification number: G01N33/573 ,  C12Q1/6886 ,  C12Q2600/112 ,  C12Q2600/136 ,  C12Q2600/158 ,  G01N33/5011 ,  G01N33/574 ,  G01N33/57419 ,  G01N2333/4704 ,  G01N2333/9015 ,  G01N2500/00 ,  G01N2500/04 ,  G01N2500/10

Abstract: 본발명은 3차원콜라겐겔 환경에서배양된암 세포주에서라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS)의작용을분석하여암 전이억제제스크리닝및 암세포의암세포덩어리로부터의이탈, 상피-중배엽세포전이(epithelial- mesenchymal transition), 이동, 침윤및 전이모니터링방법에관한것으로, 구체적으로 HCT116 세포주를포함하여다양한대장암세포를이용하여 KRS를발현하거나발현하지않도록조절된세포주나회전타원체(spheroid) 덩어리세포주를제작하여 2차원적환경에서배양할경우, KRS의발현을억제하는세포주에서불완전한상피-중간엽세포전이표현형(incomplete epithelial-to-mesenchymal transition phenotype; incomplete ECM phenotype)이유도되고, 이는 KRS의발현억제가세포-세포외기질(extracellular matrix; ECM) 부착및 세포-ECM 신호전달활성을억제하는것을확인하였다. 또한, 상기제작된회전타원체(spheroid) 세포주를수용성환경또는 3차원콜라겐겔 배양환경에서배양한경우, KRS의발현억제는중간엽(mesenchymal) 세포로세포를유도하지만, 이는세포-세포부착의와해로연결되지는못하며, 세포-ECM 부착및 이와관련된신호활성을억제함으로써 3차원콜라겐겔 배양환경에서배양한회전타원체(spheroid) 세포들로부터이탈(dissemination)의억제를초래하고, 세포미세환경내에존재하는 TGFβ1에의한세포의이탈을유도하지못함을확인함으로써암 전이억제제스크리닝및 암세포의이동, 침윤및 전이모니터링방법에사용할수 있고, 이는약물개발에필요한전임상실험시저비용고효율의부가가치를창출할수 있는스크리닝방법중의하나로유용하게사용될것이다.

公开(公告)号：KR1020140135634A

公开(公告)日：2014-11-26

申请号：KR1020140056973

申请日：2014-05-13

Applicant: 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단

Inventor： 이정원 ,  김성훈 ,  남서희 ,  김대규

IPC: C12Q1/02 ,  C12N5/09 ,  G01N33/15

CPC classification number: G01N33/573 ,  C12Q1/6886 ,  C12Q2600/112 ,  C12Q2600/136 ,  C12Q2600/158 ,  G01N33/5011 ,  G01N33/574 ,  G01N33/57419 ,  G01N2333/4704 ,  G01N2333/9015 ,  G01N2500/00 ,  G01N2500/04 ,  G01N2500/10

Abstract: 본 발명은 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 암 세포주에서 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS)의 작용을 분석하여 암 전이 억제제 스크리닝 및 암 세포의 암세포덩어리로부터의 이탈, 상피-중배엽세포 전이(epithelial- mesenchymal transition), 이동, 침윤 및 전이 모니터링 방법에 관한 것으로, 구체적으로 HCT116 세포주를 포함하여 다양한 대장암 세포를 이용하여 KRS를 발현하거나 발현하지 않도록 조절된 세포주나 회전타원체(spheroid) 덩어리 세포주를 제작하여 2차원적 환경에서 배양할 경우, KRS의 발현을 억제하는 세포주에서 불완전한 상피-중간엽세포 전이 표현형(incomplete epithelial-to-mesenchymal transition phenotype; incomplete ECM phenotype)이 유도되고, 이는 KRS의 발현 억제가 세포-세포외기질(extracellular matrix; ECM) 부착 및 세포-ECM 신호전달 활성을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 제작된 회전타원체(spheroid) 세포주를 수용성 환경 또는 3차원 콜라겐 겔 배양환경에서 배양한 경우, KRS의 발현 억제는 중간엽(mesenchymal) 세포로 세포를 유도하지만, 이는 세포-세포 부착의 와해로 연결되지는 못하며, 세포-ECM 부착 및 이와 관련된 신호활성을 억제함으로써 3차원 콜라겐 겔 배양환경에서 배양한 회전타원체(spheroid) 세포들로부터 이탈(dissemination)의 억제를 초래하고, 세포 미세환경 내에 존재하는 TGFβ1에 의한 세포의 이탈을 유도하지 못함을 확인함으로써 암 전이억제제 스크리닝 및 암 세포의 이동, 침윤 및 전이 모니터링 방법에 사용할 수 있고, 이는 약물 개발에 필요한 전임상 실험시 저비용 고효율의 부가가치를 창출할 수 있는 스크리닝 방법 중의 하나로 유용하게 사용될 것이다.

Abstract translation: 本发明涉及一种筛选癌症转移抑制剂的方法，以及通过分析赖氨酰受体的活性来监测癌细胞从癌肿块和上皮 - 间质转化，运动，渗透，转移到癌细胞的迁移的方法， tRNA合成酶（KRS）在三维胶原凝胶环境中培养的癌细胞株中。 该方法包括以下步骤：1）在由三维或细胞外基质包围的细胞培养环境中培养被调节以表达或不表达赖氨酰-tRNA合成酶（KRS）的癌细胞株或癌块; 2）用待测物质处理步骤1）的癌细胞株或癌肿块; 3）分析KRS在癌细胞株或癌症块中的活性，步骤2）; 和4）鉴定抑制步骤3）的KRS活性的物质。 预期该方法有利地用作需要低成本，高效率的筛选方法之一，并且可以在进行用于开发药物的临床前实验时产生附加值。

公开(公告)号：KR1020140135101A

公开(公告)日：2014-11-25

申请号：KR1020140055349

申请日：2014-05-09

Applicant: 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단

Inventor： 이정원 ,  김성훈 ,  이미숙

IPC: C12Q1/04 ,  C12N5/09 ,  G01N33/15

CPC classification number: G01N33/574 ,  C12N5/0693 ,  C12N2501/727 ,  C12N2503/02 ,  C12N2533/54 ,  G01N33/5011 ,  G01N33/5023 ,  G01N33/5026 ,  G01N33/5029 ,  G01N33/57415 ,  G01N2333/4703 ,  G01N2333/4704 ,  G01N2333/4706 ,  G01N2440/14 ,  G01N2500/10 ,  C12Q1/04 ,  C12Q1/00 ,  C12Q1/02 ,  G01N33/15

Abstract: 본 발명은 3차원적 환경에서 배양된 암 세포의 모양관찰, 인바도포디아(invadopodia) 형성 및 전이에 관련된 단백질의 활성, 발현 및 발현위치 변화, 세포외기질의 분해 측정을 이용한 암 세포의 이동, 침윤 및 전이성 모니터링, 및 암 전이억제제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 세포에서 c-Jun 인산화의 감소가 snail1의 발현 증가 및 코르탁틴(cortactin) 발현 감소를 유발하였고, 이러한 단백질들간의 발현조절 관계는 환자로부터 수득한 유방암 세포조직에서도 동일함을 확인하였다. 또한, 3차원적 콜라겐 겔 환경 내의 유방암 세포에 JNK 억제제를 처리하였을 때, 세포의 모양이 길어지고, 세포 및 세포외 기질의 접촉부분이 밋밋해지고 가늘어지며, 암세포의 이동이 감소하고, 단백질 발현 변화에 있어서는 TGFβ1의 발현증가, smad2 및 smad3의 발현 및 활성 증가, snail1의 발현 증가 및 코르탁틴의 발현 감소 및 이에 따른 인바도포디아의 형성 저하를 확인하였다. 또한, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 코르탁틴외에도 MT1-MMP가 다른 인바도포디아 마커로 사용될 수 있고, 이는 JNK 억제가 코르탁틴의 발현을 감소시키고, snail1의 발현을 증가시키면서 동시에 MT1-MMP의 위치 및 역할에 부정적 영항을 미쳐 인바도포디아의 형성을 억제하며, 콜라겐 겔 기질의 분해능을 억제하는 것을 확인함으로써 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법 및 암 전이억제제의 스크리닝 방법으로 사용할 수 있고, 이는 약물 개발에 필요한 전임상 실험 시 저비용 고효율의 부가가치를 창출할 수 있는 스크리닝 방법 중의 하나로 유용하게 사용될 것이다.

Abstract translation: 本发明涉及通过使用在三维胶原凝胶环境中培养的细胞来监测转移性癌细胞的可行性的方法。 根据本发明实施方案的监测方法包括以下步骤：在培养容器中由细胞外基质包围的三维培养环境中培养癌细胞; 测量和观察培养的癌细胞的形状变化，侵袭多巴胺的形成和降解，蛋白质关于迁移，侵袭和转移的活化，表达和表达位置的变化以及细胞外基质的降解程度。 本发明还提供了筛选癌症转移抑制剂的方法。