本发明提供了一种基于长读长测序进行实时病原检测的方法、系统和应用，包括(1)测序下机数据监测及定时分析启动；(2)获取测序fastq数据，并对数据进行质控；(3)质控后的数据与人的参考基因组比对，并去除比对上的reads；(4)去除人源reads的数据与微生物数据库进行比对和统计，检测报出测序数据中的病原微生物种类；(5)到达设定间隔时间后，新产生的数据顺序执行步骤(2)至(3)，并与前一个时间间隔步骤(3)产生的数据合并，执行步骤(4)。本发明能够应用长读长测序数据实时、快速、准确完成临床样本病原微生物检测，具有重要的应用价值。