公开(公告)号：CN113122571A

公开(公告)日：2021-07-16

申请号：CN202110583863.6

申请日：2021-05-27

Applicant: 华中农业大学

Inventor： 金双侠 ,  张献龙 ,  周家伟 ,  扶春阳

IPC: C12N15/82 ,  C12N15/66 ,  A01H5/00 ,  A01H6/60

Abstract: 本发明涉及植物基因工程技术领域，且公开了一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体制备方法，所述CRISPR/Cas9载体p7N‑EC通过下列步骤制备获得：获得目的序列EC1.2en‑1.1p，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：先获得含有目的序列EC1.2en‑1.1p的载体pHEE401E‑ccdB，以pHEE401E‑ccdB载体为模板，利用Primer5软件设计引物，通过PCR扩增获得EC1.2en‑1.1p目的序列，利用SbfⅠ、BstBⅠ两种酶对pRGEB32‑GhU6.7‑NPT Ⅱ载体进行双酶切去除Ubiquitin启动子得到线性载体，然后与获得的EC1.2en‑1.1p目的序列进行In‑fusion连接。该新型CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体制备方法，能对棉花基因组进行有效的基因编辑，且具有一定的基因编辑效率。

公开(公告)号：CN113122570A

公开(公告)日：2021-07-16

申请号：CN202110583854.7

申请日：2021-05-27

Applicant: 华中农业大学

Inventor： 金双侠 ,  张献龙 ,  周家伟 ,  扶春阳

IPC: C12N15/82 ,  C12N15/66 ,  A01H5/00 ,  A01H6/60

Abstract: 本发明涉及基因工程技术领域，且公开了一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体在棉花中的使用方法，包括以下步骤：获得含有目的序列35S启动子的载体pK2GW7.0，以pK2GW7.0载体为模板，利用Primer5软件设计引物。该新型CRISPR/Cas9基因编辑载体在棉花中的使用方法，对含有棉花内源启动子pGhU6‑7的pRGEB32‑GhU6.7‑NPTⅡ载体进行改造，以35S启动子取代原有系统中驱动Cas9蛋白表达的Ubiquitin启动子，分别选取棉花内源Gh_A06G0606和GhCLA为目标基因验证改造后的新系统在棉花中的应用，利用农杆菌介导的遗传转化将CRISPR/Cas9基因编辑系统导入棉花基因组，然后对新载体的愈伤组织进行Sanger测序和Hi‑TOM测序，检测新系统在异源四倍体棉花基因组中的突变位点及编辑效率，具有良好的探究性、创新性和研究价值。