公开(公告)号：CN119842796A

公开(公告)日：2025-04-18

申请号：CN202510157282.4

申请日：2025-02-12

Applicant: 华中农业大学

Inventor： 金双侠 ,  惠凤娇 ,  李波 ,  钱育强 ,  吴佳钰 ,  陈珂欣 ,  王冠英

IPC: C12N15/82 ,  C12N15/62 ,  C12N9/78 ,  C12N9/22 ,  C12N1/21 ,  A01H5/00 ,  A01H6/82 ,  A01H6/60 ,  C12R1/01

Abstract: 本发明涉及一种碱基编辑器DGhBE4max与碱基编辑方法及其应用，属于基因编辑技术领域。本发明提供了一种碱基编辑器DGhBE4max，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述碱基编辑器DGhBE4max包括脱氨酶rAPOBEC1、内毒素蛋白dDddA、nCas9蛋白、尿嘧啶糖基化酶抑制剂UGI。本发明的碱基编辑器DGhBE4max能够显著提高现有的胞嘧啶碱基编辑器在植物中的编辑效率，同时能够显著拓展碱基编辑的窗口，从而为植物功能基因的研究和关键基因的定向进化提供了一种稳定高效的技术工具。

公开(公告)号：CN113215161B

公开(公告)日：2025-04-01

申请号：CN202110609717.6

申请日：2021-06-01

Applicant: 华中农业大学

Inventor： 金双侠 ,  张献龙 ,  王茂军 ,  丁霄 ,  惠凤娇

IPC: C12N15/113 ,  C12N15/82 ,  A01H4/00 ,  A01H5/12 ,  A01H6/60

Abstract: 本发明涉及除草剂技术领域，且公开了利用单碱基编辑技术创造除草剂抗性植物的方法，包括以下步骤：1)GhEPSP基因的sgRNA设计：选择陆地棉5‑烯醇式丙酮酰莽草酸‑3‑磷酸合酶(5‑Enolpyruvylshikimate‑3‑phosphatesynthase，EPSP合酶)为验证基因，利用在线软件CRISPR‑P(http：//cbi.hzau.edu.cn/cgi‑bin/CRISPR)(Lei et al 2014)在基因外显子区域设计sgRNA靶标序列，并且在编辑窗口内C‑T突变改变氨基酸功能的靶点，最终选择1个sgRNA用来构建单碱基系统植物表达载体。该利用单碱基编辑技术创造除草剂抗性植物的方法，在棉花中首次成功应用棉花基因组特性的单碱基编辑系统对棉花GhEPSP实现单碱基突变，突变位点未见其他作物报道，通过叶片草甘膦涂抹实验，表现出一定的草甘膦耐受性，提高了棉田除草效率，降低了人工除草成本，防范棉田超级杂草。

公开(公告)号：CN113174401A

公开(公告)日：2021-07-27

申请号：CN202110608540.8

申请日：2021-06-01

Applicant: 华中农业大学

Inventor： 金双侠 ,  张献龙 ,  王茂军 ,  李波 ,  惠凤娇

IPC: C12N15/82 ,  C12N15/113 ,  C12N15/90 ,  A01H4/00 ,  A01H5/10 ,  A01H6/60

Abstract: 本发明涉及基因工程技术领域，且公开了基因编辑介导的外源基因敲入到棉花基因组的方法，包括以下步骤：1)菜豆黄矮病毒的复制子元件BeSRL和ULIR目的序列的获得：查阅文献DNA Replicons for Plant Genome Engineering从中获取菜豆黄矮病毒的复制子元件BeSRL和ULIR目的序列，然后经过(GenScript)合成；2)转化载体BeYDV‑Cas9‑KI的构建：利用限制性内切酶Sbf I酶切pRGEB32‑GhU6.7‑NPTⅡ载体，连接黄矮病毒的复制子元件BeSRL，将pRGEB32‑GhU6.7‑NPTⅡ进行Sbf I酶切。该基因编辑介导的外源基因敲入到棉花基因组的方法及载体，在棉花中首次成功建立了适应于棉花基因组特性的基因敲入编辑系统，该系统能够将外源基因定点插入到棉花基因组中，它将成为棉花功能基因组研究新的重要的技术手段，且在棉花中的敲入效率达1.0％。

公开(公告)号：CN119876242A

公开(公告)日：2025-04-25

申请号：CN202510158084.X

申请日：2025-02-12

Applicant: 华中农业大学

Inventor： 金双侠 ,  惠凤娇 ,  吴佳钰 ,  钱育强 ,  李波 ,  陈珂欣 ,  王冠英

IPC: C12N15/82 ,  C12N15/62 ,  C12N9/78 ,  C12N9/22 ,  C12N1/21 ,  A01H5/00 ,  A01H6/82 ,  A01H6/60 ,  C12R1/01

Abstract: 本发明涉及一种碱基编辑系统GhDA3A‑BE4与碱基编辑方法及其应用，属于基因编辑技术领域。本发明提供了一种碱基编辑系统GhDA3A‑BE4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述碱基编辑系统GhDA3A‑BE4包括人源脱氨酶APOBEC3A(A3A)、内毒素蛋白dDddA、nCas9蛋白、尿嘧啶糖基化酶抑制剂UGI。本发明的碱基编辑系统GhDA3A‑BE4能够显著提高在植物基因组序列靶标位点的C‑to‑T编辑效率，同时能够显著扩展碱基编辑的窗口，实现了对植物基因组序列的编码区和非编码区进行更全面的基因编辑。

公开(公告)号：CN113278647A

公开(公告)日：2021-08-20

申请号：CN202110572919.8

申请日：2021-05-25

Applicant: 华中农业大学

Inventor： 金双侠 ,  张献龙 ,  王茂军 ,  李波 ,  惠凤娇

IPC: C12N15/82 ,  C12N15/66 ,  A01H5/00 ,  A01H6/60

Abstract: 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种陆地棉基因组的高效定向基因调控的编辑方法，本发明对含有棉花内源启动子pGhU6‑7的GhBE3‑Dcas9载体进行改造，以6TAL‑2VP64+2linker+dCas9融合蛋白取代原有的APOBEC1‑XTEN‑dCas9‑UGI蛋白，构建在棉花中具有定向上调单个基因表达量的载体Gh‑dCas9‑TV。选取GhEPSP和GhPAP1D为目标基因验证Gh‑dCas9‑TV在棉花中的应用。设计2个单靶标以及一个双靶标，利用农杆菌介导的遗传转化将转录激活编辑系统导入棉花基因组，对转基因植株进行表达量检测和转录组测序，检测本发明在异源四倍体棉花基因组中的编辑效率及全基因组和全转录组检测靶标基因，非靶标基因表达量效应。本发明具有良好的编辑效率和特异性。

公开(公告)号：CN113215161A

公开(公告)日：2021-08-06

申请号：CN202110609717.6

申请日：2021-06-01

Applicant: 华中农业大学

Inventor： 金双侠 ,  张献龙 ,  王茂军 ,  丁霄 ,  惠凤娇

IPC: C12N15/113 ,  C12N15/82 ,  A01H4/00 ,  A01H5/12 ,  A01H6/60

Abstract: 本发明涉及除草剂技术领域，且公开了利用单碱基编辑技术创造除草剂抗性植物的方法，包括以下步骤：1)GhEPSP基因的sgRNA设计：选择陆地棉5‑烯醇式丙酮酰莽草酸‑3‑磷酸合酶(5‑Enolpyruvylshikimate‑3‑phosphatesynthase，EPSP合酶)为验证基因，利用在线软件CRISPR‑P(http：//cbi.hzau.edu.cn/cgi‑bin/CRISPR)(Lei et al 2014)在基因外显子区域设计sgRNA靶标序列，并且在编辑窗口内C‑T突变改变氨基酸功能的靶点，最终选择1个sgRNA用来构建单碱基系统植物表达载体。该利用单碱基编辑技术创造除草剂抗性植物的方法，在棉花中首次成功应用棉花基因组特性的单碱基编辑系统对棉花GhEPSP实现单碱基突变，突变位点未见其他作物报道，通过叶片草甘膦涂抹实验，表现出一定的草甘膦耐受性，提高了棉田除草效率，降低了人工除草成本，防范棉田超级杂草。