公开(公告)号：WO2015030479A1

公开(公告)日：2015-03-05

申请号：PCT/KR2014/007961

申请日：2014-08-27

Applicant: 한미약품 주식회사

Inventor： 강희철 ,  김진영 ,  이병선 ,  김현욱 ,  최인영 ,  권세창

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/12 ,  C12P21/02

CPC classification number: C12N9/6437 ,  C07K14/745 ,  C12N9/003 ,  C12N15/85 ,  C12P21/02 ,  C12Y105/01003 ,  C12Y304/21021

Abstract: 본 발명은 인간 혈액응고 7인자를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 a) i) GC-풍부 영역(GC-Rich region)에서 하나 이상의 CCGCCC이 제거된 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 염기서열; 및 ii) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 유전자 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 인간 혈액응고 7인자 유도체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; b) 상기 a) 단계의 발현벡터로 동물 세포주를 형질전환하는 단계; c) 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제의 존재 하에 상기 b) 단계의 형질전환된 동물 세포주를 배양하여 고효율로 인간 혈액응고 7인자 유도체를 발현하는 세포주를 선별하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계의 선별된 동물 세포주를 소디움부틸레이트, 비타민 K, 및 배지 첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 인간 혈액응고 7인자 유도체를 대량 생산하는 방법 및 인간 혈액응고 7인자 유도체를 대량 생산하는 세포주에 관한 것이다. 본 발명은 DHFR 프로모터 부위의 GC-리치(rich) 반복서열이 결실된 벡터를 이용하여 인간 혈액응고인자 7인자 유도체를 고효율 및 대량으로 발현시킬 수 있으므로, 혈우병 치료제의 제조에 유용하게 응용될 수 있다.

Abstract translation: 本发明涉及一种大量生产人凝血因子VII的方法，更具体地，涉及用于大量生产人凝血因子VII的方法和用于大量生产人凝血因子VII衍生物的细胞系，该方法 包括以下步骤：a）制备表达载体，其包括i）二氢叶酸还原酶（DHFR）启动子的碱基序列，其中在富含GC的区域中除去至少一个CCGCCC，和编码与其可操作地连接的DHFR的碱基序列，ii ）巨细胞病毒（CMV）的早期基因的碱基序列和编码与其可操作地连接的人凝血因子VII衍生物的碱基序列; b）通过使用步骤的表达载体转化动物细胞系; c）通过在DHFR抑制剂的存在下培养步骤b）的转化的动物细胞系，选择高效表达人血液凝固因子VII衍生物的细胞系; 和d）通过加入选自丁酸钠，维生素K和培养基添加剂中的至少一种来培养步骤c）的所选择的动物细胞系。 本发明可以通过使用在DHFR启动子区缺失富含GC的重复序列的载体，以高效率和大量表达人凝血因子VII衍生物，因此可用于制备 血友病治疗剂。

公开(公告)号：KR1020150026024A

公开(公告)日：2015-03-11

申请号：KR1020130104308

申请日：2013-08-30

Applicant: 한미약품 주식회사

Inventor： 강희철 ,  김진영 ,  이병선 ,  김현욱 ,  최인영 ,  권세창

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/12 ,  C12P21/02

CPC classification number: C12N9/6437 ,  C07K14/745 ,  C12N9/003 ,  C12N15/85 ,  C12P21/02 ,  C12Y105/01003 ,  C12Y304/21021

Abstract: The present invention relates to a method of mass-producing human blood coagulation factor VII. More specifically, the present invention relates to a mass-production method of human blood coagulation factor VII derivatives, and a cell line for mass-producing human blood coagulation factor VII derivatives, wherein the mass-production method of human blood coagulation factor VII derivatives comprises a) a step of manufacturing an expression vector including i) a base sequence of a dehydrofolate reductase promoter with at least one CCGCCC removed from a GC-rich region, and a base sequence operationally connected thereto and coding the dehydrofolate reductase (DHFR); and ii) a base sequence of early gene promoters of cytomegalosvirus (CMV), and a base sequence operationally connected thereto and coding the human blood coagulation factor VII derivatives; b) a step of transforming animal cell lines with the expression vector of step a); c) a step of cultivating the transformed animal cell lines at step b) under existence of dehydrofolate reductase inhibitors and selecting cell lines expressing human blood coagulation factor VII derivatives at a high efficiency; and d) a step of adding at least one selected from the group consisting of sodium butylate, vitamin K and a culture medium additive to the selected animal cell lines of step c) and cultivating. The present invention can be usefully applied to manufacture of a hemophilia medicine as the human blood coagulation factor VII derivatives can be expressed at a high efficiency and a large quantity by using a vector with GC-rich repeated sequences deleted at a DHFR promotor site.

Abstract translation: 本发明涉及一种批量生产人凝血因子VII的方法。 更具体地，本发明涉及人凝血因子VII衍生物的批量生产方法和用于大规模生产人凝血因子VII衍生物的细胞系，其中人凝血因子VII衍生物的批量生产方法包括 a）制备表达载体的步骤，所述步骤包括：i）从富含GC的区域除去至少一个CCGCCC的脱氢叶酸还原酶启动子的碱基序列和与其操作连接并编码脱氢叶酸还原酶（DHFR）的碱基序列; 和ii）巨细胞病毒（CMV）的早期基因启动子的碱基序列和与其可操作地连接并编码人血液凝固因子VII衍生物的碱基序列; b）用步骤a）的表达载体转化动物细胞系的步骤; c）在脱氢叶酸还原酶抑制剂的存在下在步骤b）中培养转化的动物细胞系的步骤，并且以高效率选择表达人凝血因子VII衍生物的细胞系; 和d）向步骤c）的所选择的动物细胞系中添加选自丁酸钠，维生素K和培养基添加剂中的至少一种的步骤，并进行培养。 本发明可有效地应用于制造血友病药物，因为人血液凝固因子VII衍生物可以通过使用在DHFR启动子位点缺失GC富集重复序列的载体以高效率和大量表达。