公开(公告)号：CN110317800A

公开(公告)日：2019-10-11

申请号：CN201910572985.8

申请日：2019-06-27

Applicant: 厦门大学

Inventor： 凌雪萍 ,  罗唯一 ,  卢英华 ,  张学良 ,  熊维德 ,  姚传义 ,  陈翠雪

IPC: C12N9/16 ,  C12N15/55 ,  C12N15/74

Abstract: 本发明公开了一种用重组短芽孢杆菌生产磷脂酶D的方法，以含有来源于Streptomyces antibioticus的PLD基因序列的质粒pUC57-PLD anti为模板，扩增PLD基因；将PLD基因与载体PNCMO2连接得到质粒PNCMO2/PLD，然后转化进E.coli保存；随后从E.coli中提取质粒PNCMO2/PLD转化进B.choshinensis得到重组菌B.choshinensis/PNCMO2-PLD，然后发酵培养，胞外表达PLD。本发明中的重组质粒稳定，细胞毒性小，可实现高密度胞外表达磷脂酶D。

公开(公告)号：CN109022390A

公开(公告)日：2018-12-18

申请号：CN201810846519.X

申请日：2018-07-27

Applicant: 厦门大学

Inventor： 卢英华 ,  熊维德 ,  曾宪海 ,  姚传义 ,  沈亮 ,  陈翠雪

IPC: C12N9/16 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶D的方法，将带有组氨酸纯化标签的重组磷脂酶D表达在大肠杆菌周质空间中，通过脱氧胆酸钠和EDTA的提取液提取后，经二步硫酸铵沉淀和打浆，阴离子交换层析和Ni2+柱亲和层析纯化得到电泳级纯度磷脂酶D。

公开(公告)号：CN109136207B

公开(公告)日：2020-12-04

申请号：CN201810843255.2

申请日：2018-07-27

Applicant: 厦门大学

Inventor： 卢英华 ,  熊维德 ,  曾宪海 ,  姚传义 ,  沈亮 ,  陈翠雪

IPC: C12N9/16 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种重组大肠杆菌生产磷脂酶D的方法，将磷脂酶D基因置于严谨型启动子控制下，在表达质粒中插入pSC101的par区域，同时使用大肠杆菌recA突变株保持质粒的遗传稳定，生长期富集含质粒的细胞培养至高密度，诱导期饱和诱导，同时降低温度和施加碱金属盐胁迫，缓解PLD对宿主的细胞毒性，抑制细胞裂解，延长PLD的合成时间，从而提高PLD的表达。

公开(公告)号：CN109136207A

公开(公告)日：2019-01-04

申请号：CN201810843255.2

申请日：2018-07-27

Applicant: 厦门大学

Inventor： 卢英华 ,  熊维德 ,  曾宪海 ,  姚传义 ,  沈亮 ,  陈翠雪

IPC: C12N9/16 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种重组大肠杆菌生产磷脂酶D的方法，将磷脂酶D基因置于严谨型启动子控制下，在表达质粒中插入pSC101的par区域，同时使用大肠杆菌recA突变株保持质粒的遗传稳定，生长期富集含质粒的细胞培养至高密度，诱导期饱和诱导，同时降低温度和施加碱金属盐胁迫，缓解PLD对宿主的细胞毒性，抑制细胞裂解，延长PLD的合成时间，从而提高PLD的表达。

公开(公告)号：CN110317800B

公开(公告)日：2021-04-27

申请号：CN201910572985.8

申请日：2019-06-27

Applicant: 厦门大学

Inventor： 凌雪萍 ,  罗唯一 ,  卢英华 ,  张学良 ,  熊维德 ,  姚传义 ,  陈翠雪

IPC: C12N9/16 ,  C12N15/55 ,  C12N15/74

Abstract: 本发明公开了一种用重组短芽孢杆菌生产磷脂酶D的方法，以含有来源于Streptomyces antibioticus的PLD基因序列的质粒pUC57‑PLD anti为模板，扩增PLD基因；将PLD基因与载体PNCMO2连接得到质粒PNCMO2/PLD，然后转化进E.coli保存；随后从E.coli中提取质粒PNCMO2/PLD转化进B.choshinensis得到重组菌B.choshinensis/PNCMO2‑PLD，然后发酵培养，胞外表达PLD。本发明中的重组质粒稳定，细胞毒性小，可实现高密度胞外表达磷脂酶D。

公开(公告)号：CN109022390B

公开(公告)日：2020-10-27

申请号：CN201810846519.X

申请日：2018-07-27

Applicant: 厦门大学

Inventor： 卢英华 ,  熊维德 ,  曾宪海 ,  姚传义 ,  沈亮 ,  陈翠雪

IPC: C12N9/16 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶D的方法，将带有组氨酸纯化标签的重组磷脂酶D表达在大肠杆菌周质空间中，通过脱氧胆酸钠和EDTA的提取液提取后，经二步硫酸铵沉淀和打浆，阴离子交换层析和Ni2+柱亲和层析纯化得到电泳级纯度磷脂酶D。