公开(公告)号：CN114381552A

公开(公告)日：2022-04-22

申请号：CN202111667501.1

申请日：2021-12-31

Applicant: 安徽农业大学 ,  安徽省动物疫病预防与控制中心 ,  安徽省兽药饲料监察所

Inventor： 祁克宗 ,  杨侃侃 ,  张吴隐 ,  邵颖 ,  宋祥军 ,  涂健 ,  刘红梅 ,  姬凯元 ,  朱良强 ,  吴昊 ,  王立 ,  刘发全

IPC: C12Q1/70 ,  C12Q1/6844 ,  C12N15/11

Abstract: 本发明涉及生物技术领域，且公开了一种基于CRISPR‑Cas12a检测猪圆环4型病毒的引物、探针及检测方法，包括以下操作步骤：(1)组织样品的处理；(2)病毒DNA的提取；(3)引物设计；(4)PCR产物回收及纯化；(5)标准质粒的构建；(6)重组质粒鉴定；(7)质粒DNA小量抽提；(8)crRNA纯化；(9)猪圆环病毒4型CRISPR‑Cas12a检测体系建立；(10)实验结果；本研究在CRISPR技术的基础上与ERA技术相结合，建立了PCV4的快速检测方法，该方法敏感性高、特异性高、操作简单、检测时间短、结果分析简单、抗干扰性强、不需要复杂仪器设备，对于冷链运输和非专业人员，即使偏远地区也能对疫病进行实时监测，为PCV4的流行病学的调查，掌握其传播规律以及疫病的防控提供技术支持。

公开(公告)号：CN114277099A

公开(公告)日：2022-04-05

申请号：CN202210000997.5

申请日：2022-01-04

Applicant: 安徽农业大学 ,  安徽省动物疫病预防与控制中心 ,  安徽省兽药饲料监察所

Inventor： 宋祥军 ,  涂健 ,  李雅男 ,  祁钊 ,  邵颖 ,  杨侃侃 ,  刘红梅 ,  姬凯元 ,  朱良强 ,  吴昊 ,  王立 ,  刘发全

IPC: C12Q1/6816 ,  C12Q1/70 ,  C12N15/11 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明涉及病毒检测技术领域，且公开了一种PPV检测的crRNA引物对、CRISPRCas12a系统及应用方法，包括以下步骤：S1、组织样品的处理：将称取约1g的各组织样品，加入1mL PBS后放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以12000rpm/min离心3min；S2、病毒核酸的提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒对病毒进行核酸提取；S3、引物设计：在GenBank中检索猪细小病毒全基因组(GenBank ID:NC_001718.1)，通过Meglign软件分析比对，确定猪细小病毒全基因组中高度保守片段为VP2基因，使用Primer Premier 5软件，设计VP2基因的全长引物，根据猪细小病毒全基因组中高度保守片段VP2基因，使用CRISPR‑DT网站中Cpf1引物设计软件设计猪细小病毒VP2基因的crRNA引物，并委托某生物公司合成生产。

公开(公告)号：CN111663006A

公开(公告)日：2020-09-15

申请号：CN201910670632.1

申请日：2019-07-24

Applicant: 安徽农业大学

Inventor： 王勇 ,  张达 ,  白彩霞 ,  王小朋 ,  赵靓 ,  杨侃侃 ,  俞赵荣

IPC: C12Q1/70 ,  C12Q1/6844 ,  C12N15/11

Abstract: 本发明公开了一种检测猪细小病毒7型的环介导等温扩增方法的引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其中所述一对外引物包括F3和B3；所述一对内引物包括FIP和BIP；所述一对环引物LF和LB；本发明进一步公开了一种包含上述引物组的试剂盒，该试剂盒包括所述引物组、等温扩增反应缓冲液、Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶、dNTP Mix、MgSO4、超纯水和荧光显色检测试剂。本发明提供一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒，本发明污染小，操作简便、快速、可用肉眼直接观察结果。具有特异性强、灵敏度高等优点，无需昂贵仪器设备，尤其便于基层使用。

公开(公告)号：CN114990244A

公开(公告)日：2022-09-02

申请号：CN202210724003.4

申请日：2022-06-23

Applicant: 安徽农业大学

Inventor： 祁克宗 ,  宋祥军 ,  程越 ,  杨侃侃 ,  涂健 ,  邵颖 ,  薛挺 ,  周育 ,  王振宇

IPC: C12Q1/689 ,  C12Q1/6806 ,  C12Q1/6844 ,  C12R1/445

Abstract: 本发明涉及基因工程技术领域，且公开了一种基于MIRA荧光法快速检测金黄色葡萄球菌的检测方法，包括以下步骤：S1、细菌培养：将‑80℃保存的金黄色葡萄球菌菌液取出，使用“四区划线法”于LB固体培养基和血平板培养基上进行复苏培养，在37℃的恒温培养箱中培养12‑16h，挑取单菌落于1.5mL的LB液体培养基中，在37℃的恒温摇床中培养3‑6h后，以1∶100比例转接到20mL的液体培养基中，培养至菌液混浊备用；本发明通过MIRA技术来进行金黄色葡萄球均的检测，具有检测时间短、检测温度低、仪器设备要求不高、特异性强、灵敏度高等优点，从而提供了分子生物学的检测效率，降低了检测门槛，节省了检测的时间。

公开(公告)号：CN111690769A

公开(公告)日：2020-09-22

申请号：CN201910670437.9

申请日：2019-07-24

Applicant: 安徽农业大学

Inventor： 王勇 ,  赵靓 ,  王小朋 ,  杨侃侃 ,  张达 ,  白彩霞 ,  孙裴

IPC: C12Q1/70 ,  C12Q1/6851

Abstract: 本发明公开了一种猪细小病毒7型SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：S1、制备特异性引物；根据Gen Bank登录的PPV7(Gen Bank:KU563733.1)Cap基因核苷酸序列，设计用于PPV7的特异性引物(F1、R1)；PPV7特异性引物上游引物F1：PPV7-F1(5'-GCGACCAGTCGAAAGTCTTC-3')，PPV7特异性引物下游引物R1：PPV7-R1(5'-TTGGTGTTGCCCATTCTGTA-3')，扩增核酸片段大小为169bp；S2、重组质粒标准品制备并提取DNA；本发明为建立一种能够快速、特异、敏感、简便、特异性好的检测猪细小病毒7型的SYBR Green I荧光定量PCR方法，本发明根据Gen Bank登录的PPV7(Gen Bank:KU563733.1)Cap基因核苷酸序列，设计一对用于PPV7的特异性引物，扩增169bp的PPV7衣壳蛋白基因，构建重组质粒，以其作为标准品建立了SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，得到标准曲线、溶解曲线，并对灵敏性、特异性和重复性进行验证。

公开(公告)号：CN117604166A

公开(公告)日：2024-02-27

申请号：CN202311318676.0

申请日：2021-12-31

Applicant: 安徽农业大学 ,  安徽省动物疫病预防与控制中心 ,  安徽省兽药饲料监察所

Inventor： 邵颖 ,  宋祥军 ,  吴昊 ,  刘发全 ,  朱良强 ,  杨侃侃 ,  张吴隐 ,  祁克宗 ,  涂健 ,  刘红梅 ,  王立

IPC: C12Q1/70 ,  C12Q1/6844 ,  C12N15/11 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明涉及生物技术领域，且公开了一种用于检测猪圆环4型病毒的引物对及检测方法，包括ERA引物对和crRNA引物对，其中crRNA引物对为PCV4‑crRNA‑1、PCV4‑crRNA‑2、PCV4‑crRNA‑3中的任意一对。本研究在CRISPR技术的基础上与ERA技术相结合，建立了PCV4的快速检测方法，该方法敏感性高、特异性高、操作简单、检测时间短、结果分析简单、抗干扰性强、不需要复杂仪器设备，对于冷链运输和非专业人员，即使偏远地区也能对疫病进行实时监测，为PCV4的流行病学的调查，掌握其传播规律以及疫病的防控提供技术支持。

公开(公告)号：CN114774591A

公开(公告)日：2022-07-22

申请号：CN202210594468.2

申请日：2022-05-27

Applicant: 安徽农业大学 ,  安徽省动物疫病预防与控制中心

Inventor： 宋祥军 ,  祁钊 ,  王景芳 ,  杨侃侃 ,  涂健 ,  邵颖 ,  刘华 ,  朱良强 ,  陈曦 ,  王勇 ,  王振宇

IPC: C12Q1/70 ,  C12Q1/686 ,  C12N15/11 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明涉及基因工程技术领域，且公开了一种基于CRISPR/Cas12a系统的鸡传染性贫血病毒的检测方法，包括以下步骤：S1、组织样品的处理：将称取约1g的各组织样品，加入1mL PBS后放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpm/min离心3min；S2、病毒核酸提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(离心柱型)提取病毒RNA；本发明将CRISPR/Cas12a系统与ERA技术相结合，建立鸡传染性贫血病毒快速分子检测方法，该方法具有可视化、敏感性高、特异性强、不依赖贵重仪器设备等优点，整个检测过程只需1h左右，为鸡传染性贫血病毒快速诊断提供新的手段，对免疫抑制性病毒的监测具有重要意义。

公开(公告)号：CN113528613A

公开(公告)日：2021-10-22

申请号：CN202110805340.1

申请日：2021-07-16

Applicant: 安徽农业大学 ,  安徽大自然种猪股份有限公司 ,  芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 ,  安徽昌农农牧食品有限公司

Inventor： 邵颖 ,  杨侃侃 ,  祁钊 ,  王成 ,  涂健 ,  宋祥军 ,  姚臣 ,  杨正庆 ,  祖坤 ,  赵俊 ,  许成虎 ,  周师义

IPC: C12Q1/6806 ,  C12Q1/689 ,  C12Q1/6844 ,  C12Q1/10 ,  C12R1/42

Abstract: 本发明涉及基因工程技术领域，且公开了一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，包括如下实验步骤：S1、细菌基因组DNA提取；S2、引物与探针设计；S3、目的片段PCR扩增；S4、PCR产物回收及纯化；S5、标准质粒的构建；S6、重组质粒鉴定；S7、MIRA体系的建立；S8、MIRA引物筛选；S9、灵敏度试验；S10、特异性试验；S11、重复性试验；S12、临床样本检测；本实验应用多酶恒温快速扩增技术分别针对沙门氏菌中invA基因，筛选合适的引物和探针，本实验建立的MIRA诊断技术方便快捷，便于规模化畜禽养殖场的快速大规模检测诊断，此种方法具有较高的特异性、高度的灵敏性、实验所需仪器简单便捷并且反应所需时间短，适合临床的紧急样本的快速检测诊断。

公开(公告)号：CN115074464A

公开(公告)日：2022-09-20

申请号：CN202210725368.9

申请日：2022-06-23

Applicant: 安徽农业大学

Inventor： 涂健 ,  邵颖 ,  魏静 ,  杨侃侃 ,  宋祥军 ,  祁克宗 ,  王振宇

IPC: C12Q1/70 ,  C12Q1/6806 ,  C12Q1/6844 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明涉及基因工程技术领域，且公开了一种基于MIRA荧光法快速检测马立克氏病病毒的检测方法，包括以下步骤：S1、组织样品处理：称取约1g的各组织样品，加图1mL PBS后放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpm/min离心3min；S2、病毒基因组DNA提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取病毒基因组；本发明针对马立克氏病Meq基因的保守序列，设计了专门的引物和探针，并且使用多酶恒温快速扩增技术(MIRA)对马立克氏病，建立一种在常温下能快速扩增核酸的技术，提高了分子生物学的检测效率，降低了检测门槛，节省了检测时间。

公开(公告)号：CN114959115A

公开(公告)日：2022-08-30

申请号：CN202210593501.X

申请日：2022-05-27

Applicant: 安徽农业大学

Inventor： 邵颖 ,  祁钊 ,  杨侃侃 ,  孙会会 ,  宋祥军 ,  涂健 ,  刘红梅 ,  王勇 ,  王振宇

IPC: C12Q1/70 ,  C12Q1/686 ,  C12Q1/6806 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明涉及基因工程技术领域，且公开了一种基于MIRA荧光法快速检测GAstV的检测方法，包括以下步骤：S1、组织样品的处理：将称取1g的各组织样品，加入1mL PBS放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpm/min离心3min；S2、病毒核酸的提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(离心柱型)提取病毒RNA；本发明GAstV ORF2基因的保守区域设计了特异性的引物和探针，并使用MIRA技术对GAstV进行核酸扩增，建立了GAstV的快速检测方法。该方法提高了生物学的检测效率，降低了检测门槛，节省了检测时间，并且操作简单，对仪器设备要求不高且二十分钟内就能得到结果，即使偏远地区也能对疫病进行实时监测。