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公开(公告)号：CN114395583B
公开(公告)日：2024-03-29
申请号：CN202111284075.3
申请日：2021-11-01
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明公开了一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过两次体外同源重组试验，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒RNA反转录产物的基因片段插入pACYC177载体中，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆，并且病毒基因组上游和下游分别添加了CMV早期启动子和丁型肝炎病毒的核酶序列。本发明构建方法效率高，得到的感染性cDNA克隆拯救的病毒感染后分泌gaussia luciferase到细胞外，便于对病毒滴度的检测，且保持遗传稳定。
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公开(公告)号：CN113736799B
公开(公告)日：2024-02-06
申请号：CN202111092942.3
申请日：2021-09-17
Abstract: 本发明提供山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用，属于生物技术领域。该构建方法包括：以山羊副流感病毒3型的总RNA反转录产物为模板，扩增A、B、C和D片段；将片段A和B、片段C和D分别插入pCI‑neo‑1载体中，得到重组载体pCI‑A‑B、pCI‑C‑D；以pCI‑A‑B为模板，扩增片段A‑B；以pCI‑C‑D为模板，扩增C‑D片段；将线性化pYES1L载体、A‑B和C‑D片段混和，导入酵母内进行同源重组，得到山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆质粒。本发明构建方法效率高，得到的感染性cDNA克隆拯救的病毒感染细胞后能够快速产生细胞病变，病毒滴度高，且保持稳定。
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公开(公告)号：CN115725622B
公开(公告)日：2025-01-21
申请号：CN202211147357.3
申请日：2022-09-19
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明涉及一株表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒及其构建方法与应用，利用同源重组技术将ASFV P30蛋白基因克隆入上游设置T7启动子的GI型日本脑炎病毒基因组中的5′UTR与C基因之间；P30蛋白基因的上游携带有日本脑炎病毒C基因的前102个碱基序列，保证了重组病毒的稳定；P30蛋白基因的下游含有T2A序列，保证了ASFV P30蛋白能够被正确的剪切。获得重组病毒的基因组全长cDNA后，利用T7启动子进行体外转录，获得病毒RNA并转染BHK‑21细胞，待细胞出现典型的细胞病变时，收集细胞上清即可获得表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒。该重组病毒具有遗传稳定型，能够稳定、高效的表达ASFV P30蛋白。本发明可快速获得含有ASFV和GI型JEV免疫原的重组病毒，为开发多效价疫苗奠定基础。
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公开(公告)号：CN114395568A
公开(公告)日：2022-04-26
申请号：CN202111274202.1
申请日：2021-10-29
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明提供了猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法及其应用，本发明属于生物技术领域。该构建方法包括：以猪流行性腹泻病毒的基因组RNA反转录产物为模板，扩增F1、F2、F3、F4、F5、F6和F7片段；基于酵母内同源重组机制，将线性化的pYES1L载体和F1～F7片段混合、转化如酵母感受态细胞，从而实现病毒cDNA片段与原载体的一步无缝连接得到猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆质粒；基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，将病毒ORF3编码区替换成绿色荧光蛋白基因，构建表达绿色荧光蛋白的重组猪流行性腹泻病毒。本发明所述方法快速简便、成功率高，可用于拯救猪流行性腹泻病毒及其它冠状病毒，为研究该病毒的复制机制、致病机理以及开发新型疫苗提供可靠的技术平台。
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公开(公告)号：CN118652354B
公开(公告)日：2025-04-04
申请号：CN202410964977.9
申请日：2024-07-18
Applicant: 扬州大学
IPC: C07K19/00 , C12N9/02 , C12N15/85 , C12N15/62 , G01N33/569 , G01N33/58 , G01N33/535 , G01N33/533 , G01N33/543
Abstract: 本发明公开了一种猪盖他病毒的融合抗原、试剂盒及其制备方法和应用，所述盖他病毒的融合抗原，主要采用将高斯萤光素酶基因与密码子优化的GETV E2抗原基因进行重组获得表达载体，随后，将含有GLuc‑E2的表达载体转染到哺乳动物细胞系中，GLuc‑E2蛋白会以分泌形式表达于细胞上清中。无需进行蛋白纯化步骤，直接收取细胞上清即可用于疾病的检测。本发明特异性强，与非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪日本脑炎病毒不发生交叉反应。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN115073613B
公开(公告)日：2025-02-11
申请号：CN202210747717.7
申请日：2022-06-28
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明涉及一种融合蛋白GLuc‑p30及其制备方法和应用，以非洲猪瘟的p30蛋白为诊断抗原，建立了一种基于荧光素酶免疫沉淀系统的非洲猪瘟抗体检测方法，该方法通过DNA转染真核细胞制备荧光素酶与p30的融合抗原，将该抗原分泌到细胞外，融合抗原与血清样本中的非洲猪瘟抗体结合后，被金黄色葡萄球菌A蛋白偶联的磁珠捕获，经荧光素酶试验检测与磁珠特异性结合的融合抗原；本发明使用的真核细胞表达的病毒抗原含有磷酸化等翻译后修饰，与感染情况下表达的病毒蛋白更相近，且无需纯化，简化了抗原的准备过程；与现有的间接ELISA相比，本发明的检测方法具有更好的检测的灵敏性和特异性；本发明检测方法具有简单、敏感、特异、价廉等优点，可以满足大规模检测的要求。
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公开(公告)号：CN114395579B
公开(公告)日：2024-04-19
申请号：CN202111276598.3
申请日：2021-10-29
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明公开了一种基因I型与基因III型日本脑炎病毒感染性克隆及其构建方法与应用，属于分子生物学技术领域。本发明通过设计四对保守引物，分四段一次扩增出涵盖基因I型与基因III型JEV基因组全长的片段，基于DNA片段末端的同源性，利用酵母菌中的转化偶联重组技术，将分段的病毒基因组片段与线性化载体进行同源重组，一次性分别构建出携带基因I型与基因III型JEV基因组全长的重组质粒。重组质粒线性化处理后，利用T7启动子经体外转录出病毒RNA，RNA转染BHK‑21细胞后即可获得感染性克隆病毒。本发明可在酵母菌中稳定传代10代以上，不存在基因组本身序列的突变、缺失或外源序列的插入。
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公开(公告)号：CN115786280A
公开(公告)日：2023-03-14
申请号：CN202210997589.1
申请日：2022-08-19
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明公开了一株稳定表达红色荧光蛋白mCherry的重组GI型日本脑炎病毒及其构建方法与应用。具体地，本发明利用重组克隆技术，将一段C38‑mCherry‑T2A基因序列SEQ ID NO.1插入到GI型日本脑炎病毒基因组的5′UTR与C基因之间，构建获得含有T7启动子的重组病毒感染性克隆。利用体外转录技术获得重组病毒的基因组RNA全长，并转染至BHK‑21细胞中，当细胞出现典型的病变时，收取细胞上清即可获得表达mCherry蛋白的重组病毒。该重组病毒能够稳定高效地表达mCherry蛋白，插入的mCherry基因在病毒连续传代过程中具有遗传稳定性，且不影响病毒蛋白的翻译、加工以及病毒的复制能力。本发明所述的稳定表达红色荧光蛋白mCherry的重组GI型日本脑炎病毒在抗病毒药物筛选方面具有广泛的应用价值。
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公开(公告)号：CN115725622A
公开(公告)日：2023-03-03
申请号：CN202211147357.3
申请日：2022-09-19
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明涉及一株表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒及其构建方法与应用，利用同源重组技术将ASFV P30蛋白基因克隆入上游设置T7启动子的GI型日本脑炎病毒基因组中的5′UTR与C基因之间；P30蛋白基因的上游携带有日本脑炎病毒C基因的前102个碱基序列，保证了重组病毒的稳定；P30蛋白基因的下游含有T2A序列，保证了ASFV P30蛋白能够被正确的剪切。获得重组病毒的基因组全长cDNA后，利用T7启动子进行体外转录，获得病毒RNA并转染BHK‑21细胞，待细胞出现典型的细胞病变时，收集细胞上清即可获得表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒。该重组病毒具有遗传稳定型，能够稳定、高效的表达ASFV P30蛋白。本发明可快速获得含有ASFV和GI型JEV免疫原的重组病毒，为开发多效价疫苗奠定基础。
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公开(公告)号：CN114395579A
公开(公告)日：2022-04-26
申请号：CN202111276598.3
申请日：2021-10-29
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明公开了一种基因I型与基因III型日本脑炎病毒感染性克隆及其构建方法与应用，属于分子生物学技术领域。本发明通过设计四对保守引物，分四段一次扩增出涵盖基因I型与基因III型JEV基因组全长的片段，基于DNA片段末端的同源性，利用酵母菌中的转化偶联重组技术，将分段的病毒基因组片段与线性化载体进行同源重组，一次性分别构建出携带基因I型与基因III型JEV基因组全长的重组质粒。重组质粒线性化处理后，利用T7启动子经体外转录出病毒RNA，RNA转染BHK‑21细胞后即可获得感染性克隆病毒。本发明可在酵母菌中稳定传代10代以上，不存在基因组本身序列的突变、缺失或外源序列的插入。
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