公开(公告)号：CN119876077A

公开(公告)日：2025-04-25

申请号：CN202411890789.2

申请日：2024-12-20

Applicant: 江南大学

Inventor： 刘延峰 ,  刘龙 ,  储未然 ,  田荣臻 ,  陈坚 ,  堵国成 ,  李江华 ,  武耀康 ,  吕雪芹

IPC: C12N9/12 ,  C12N15/54 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P19/34 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明涉及一种合成单链DNA的T7RNA聚合酶突变体及其筛选方法与应用，属于酶工程技术领域。本发明提供了一种T7RNA聚合酶突变体的定向进化和筛选的方法，首先在底盘菌株基因组中敲除核酸外切酶和错配修复蛋白，敲入单链退火蛋白、含有缺失突变的抗性基因和单链DNA合成模板，构建得到用于筛选的基因工程菌，之后构建T7RNA聚合酶突变体文库，将带有突变体文库的重组质粒转入工程菌中，T7RNA聚合酶突变体合成单链DNA修复抗性基因的缺失突变，使转化后的工程菌能够在抗性平板上生长，经过多轮筛选得到的T7RNA聚合酶突变体经体外验证能够高效合成单链DNA，为单链DNA的合成提供了一种全新的工具，具有应用于基因编辑和进化工程等领域的潜力。

公开(公告)号：CN119876078A

公开(公告)日：2025-04-25

申请号：CN202411890792.4

申请日：2024-12-20

Applicant: 江南大学

Inventor： 刘延峰 ,  陈坚 ,  刘龙 ,  堵国成 ,  李江华 ,  武耀康 ,  吕雪芹 ,  储未然

IPC: C12N9/12 ,  C12N15/70 ,  C12N15/81 ,  C12Q1/04 ,  C07K14/395 ,  C12N15/31 ,  C12N1/19 ,  C12R1/865 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明涉及一种基于T7RNA聚合酶突变体的连续进化系统及其应用，属于进化工程技术领域。本发明以拥有合成单链DNA能力的T7RNA聚合酶突变体为基础，构建包含单链DNA合成模板和T7RNA聚合酶突变体的连续进化系统，将连续进化系统导入宿主，T7RNA聚合酶突变体通过合成单链DNA与目的基因发生重组，使宿主在连续传代的过程中构建得到突变体文库，对宿主施加筛选压力，宿主实现连续进化。应用该系统在7天内完成了对四环素外排泵蛋白的进化，在24小时内修复了酿酒酵母的色氨酸缺陷，筛选得到的四环素外排泵蛋白突变体能够耐受四环素和替加环素，对替加环素的耐受上升了8倍，对四环素的耐受上升了2倍，对提升细胞工厂性能具有重要意义。