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公开(公告)号：CN109022471B
公开(公告)日：2021-07-20
申请号：CN201810864547.4
申请日：2018-08-01
Applicant: 武汉康复得生物科技股份有限公司
IPC: C12N15/70 , C12N9/02 , C12Q1/26 , A61K38/44 , A61P19/06 , A61P13/12 , A61P13/04 , C02F3/34 , A23L29/00 , C02F101/34 , C02F103/28
Abstract: 本发明公开了生产草酸氧化酶的大肠杆菌表达系统、草酸氧化酶的生产方法及其应用。所述大肠杆菌表达系统中的重组表达质粒包含：草酸氧化酶基因、分子伴侣基因和促进锰离子泵入大肠杆菌细胞相关蛋白的基因。本发明通过对不同的锰离子相关蛋白的基因及其拷贝数，控制分子伴侣表达的启动子种类，以及草酸氧化酶的生产过程所用的培养基种类进行筛选和测试，获得草酸氧化酶的优化表达组合，使得草酸氧化酶在大肠杆菌中的表达活力超过80U/mL。细胞破碎液上清初步纯化的草酸氧化酶的比活力大于20U/mg，单体分子量大小在25kDa左右。本发明技术方案具有生产和纯化工艺简单，表达量和比活力高，易于工业放大，成本低，有利于这类酶的工业化生产和应用等优势。
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公开(公告)号：CN106906227B
公开(公告)日：2020-02-21
申请号：CN201710133625.9
申请日：2017-03-08
Applicant: 武汉康复得生物科技股份有限公司
Abstract: 本发明公开了一种用于高效表达可溶性草酸脱羧酶的重组表达框，同时发明一种能在大肠杆菌中高效表达可溶性且有活性的草酸氧化酶的制备方法，并将细胞破碎液上清通过硫酸铵沉淀，用柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液复溶后的含草酸氧化酶的溶液，直接用于草酸脱羧酶活力测定。这种测定方法与传统的方法如市售的测定草酸的试剂盒和HPLC法相比，精确度和灵敏度较高，耗时短，成本低，易于通过酶标仪对大量的样品进行高通量测定，具有很好的实用性。本发明中制备的草酸氧化酶还可用于其它以草酸为底物或产物的酶的活力的测定，还可用于人和动物的血液和尿液以及各种含草酸的样品中草酸含量的测定。
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公开(公告)号：CN106939315A
公开(公告)日：2017-07-11
申请号：CN201710015055.3
申请日：2017-01-09
Applicant: 武汉康复得生物科技股份有限公司
CPC classification number: C12N9/88 , C12N15/75 , C12N2830/34 , C12Y401/01002
Abstract: 本发明公开了一种草酸脱羧酶的制备方法，首先构建包含芽胞杆菌属的酸诱导启动子和分泌信号肽以及在其调控下配置的真菌来源的草酸脱羧酶基因的重组表达质粒载体，用该载体转化可以在pH≤4.5下正常生长的芽胞杆菌，制备草酸脱羧酶重组菌。将该重组菌在发酵培养基中培养补加酸后进行诱导，通过简单纯化回收产生的胞外草酸脱羧酶。本发明方法制备的胞外草酸脱羧酶用于诊断试剂原料，药物组合物、保健食品或特殊医学用途配方食品的原料。采用突变的酸诱导启动子替换重组表达载体中的原始酸诱导启动子，转化芽胞杆菌能获得更高的表达量。
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公开(公告)号：CN106939315B
公开(公告)日：2020-09-18
申请号：CN201710015055.3
申请日：2017-01-09
Applicant: 武汉康复得生物科技股份有限公司
Abstract: 本发明公开了一种草酸脱羧酶的制备方法，首先构建包含芽孢杆菌属的酸诱导启动子和分泌信号肽以及在其调控下配置的真菌来源的草酸脱羧酶基因的重组表达质粒载体，用该载体转化可以在pH≤4.5下正常生长的的芽孢杆菌，制备草酸脱羧酶重组菌。将该重组菌在发酵培养基中培养补加酸后进行诱导，通过简单纯化回收产生的胞外草酸脱羧酶。本发明方法制备的胞外草酸脱羧酶用于诊断试剂原料，药物组合物、保健食品或特殊医学用途配方食品的原料。采用突变的酸诱导启动子替换重组表达载体中的原始酸诱导启动子，转化芽孢杆菌能获得更高的表达量。
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公开(公告)号：CN108977455A
公开(公告)日：2018-12-11
申请号：CN201810865726.X
申请日：2018-08-01
Applicant: 武汉康复得生物科技股份有限公司
Abstract: 本发明公开了用于生产草酸脱羧酶的重组质粒、大肠杆菌表达系统及方法和应用。所述用于生产草酸脱羧酶的重组质粒，包含：草酸脱羧酶基因、分子伴侣基因和调控胞内锰离子浓度的基因。本发明将所述重组质粒导入大肠杆菌表达菌株和MntP基因缺失的大肠杆菌中，均得到可溶表达且有活性的草酸脱羧酶。并对重组菌株的培养温度和诱导温度进行了优化，发现培养温度为37℃，诱导温度为25℃时，草酸脱羧酶的表达量较高。通过有机溶剂沉淀和硫酸铵沉淀两步简单纯化，草酸脱羧酶比活力能达到45.6U/mg，纯度超过95％。本发明技术方案具有生产和纯化工艺简单，草酸脱羧酶的表达量和比活力高，易于工业放大，成本低，有利于草酸脱羧酶的工业化生产和应用。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN108998462A
公开(公告)日：2018-12-14
申请号：CN201810863252.5
申请日：2018-08-01
Applicant: 武汉康复得生物科技股份有限公司
Abstract: 本发明公开了含锰离子重组蛋白的大肠杆菌表达系统及其应用方法。所述大肠杆菌表达系统中的重组表达质粒为以下几种情形之一或其组合：(1)至少包含大肠杆菌分子伴侣基因和含锰离子的酶蛋白基因；(2)包含大肠杆菌分子伴侣基因、含锰离子的酶蛋白基因，以及过表达或抑制锰离子通道相关蛋白基因；(3)包含大肠杆菌分子伴侣基因、含锰离子的酶蛋白基因，以及影响胞内的锰离子浓度相关蛋白基因。通过所述大肠杆菌表达系统的构建及优化，可实现含锰离子酶蛋白的高效可溶且有活性的表达，相比传统方法效率高、纯化工艺简单、成本低，有利于含锰离子酶的工业化生产和应用。
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公开(公告)号：CN105695441A
公开(公告)日：2016-06-22
申请号：CN201610217032.6
申请日：2016-04-08
Applicant: 武汉康复得生物科技股份有限公司
CPC classification number: C12N9/88 , A23V2002/00 , A61K38/00 , C12Y401/01002 , A23V2200/30
Abstract: 本发明公开了一种草酸脱羧酶及草酸脱羧酶的重组表达方法，该草酸脱羧酶为通过大肠杆菌表达系统进行重组表达，并在pH＜3.0时稳定且有活力；表达过程中该草酸脱羧酶的蛋白序列较原生酶蛋白序列缺失信号肽片段。重组表达方法适用于pH低于3.0时仍有活力的草酸脱羧酶，是将优化后草酸脱羧酶编码基因的DNA片段与大肠杆菌表达载体按照3～9:1的摩尔比混合进行连接，构建重组表达载体，重组表达载体转化DH5a感受态细胞；通过PCR及测序验证来筛选构建成功的重组表达载体转化菌，培养后抽取重组表达载体，转化含有分子伴侣的大肠杆菌表达菌株，15～30℃培养并诱导蛋白表达。提高了表达效率，简化生产步骤，降低生产成本。
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公开(公告)号：CN108977455B
公开(公告)日：2021-07-20
申请号：CN201810865726.X
申请日：2018-08-01
Applicant: 武汉康复得生物科技股份有限公司
Abstract: 本发明公开了用于生产草酸脱羧酶的重组质粒、大肠杆菌表达系统及方法和应用。所述用于生产草酸脱羧酶的重组质粒，包含：草酸脱羧酶基因、分子伴侣基因和调控胞内锰离子浓度的基因。本发明将所述重组质粒导入大肠杆菌表达菌株和MntP基因缺失的大肠杆菌中，均得到可溶表达且有活性的草酸脱羧酶。并对重组菌株的培养温度和诱导温度进行了优化，发现培养温度为37℃，诱导温度为25℃时，草酸脱羧酶的表达量较高。通过有机溶剂沉淀和硫酸铵沉淀两步简单纯化，草酸脱羧酶比活力能达到45.6U/mg，纯度超过95％。本发明技术方案具有生产和纯化工艺简单，草酸脱羧酶的表达量和比活力高，易于工业放大，成本低，有利于草酸脱羧酶的工业化生产和应用。
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公开(公告)号：CN108998462B
公开(公告)日：2021-06-18
申请号：CN201810863252.5
申请日：2018-08-01
Applicant: 武汉康复得生物科技股份有限公司
Abstract: 本发明公开了含锰离子重组蛋白的大肠杆菌表达系统及其应用方法。所述大肠杆菌表达系统中的重组表达质粒为以下几种情形之一或其组合：(1)至少包含大肠杆菌分子伴侣基因和含锰离子的酶蛋白基因；(2)包含大肠杆菌分子伴侣基因、含锰离子的酶蛋白基因，以及过表达或抑制锰离子通道相关蛋白基因；(3)包含大肠杆菌分子伴侣基因、含锰离子的酶蛋白基因，以及影响胞内的锰离子浓度相关蛋白基因。通过所述大肠杆菌表达系统的构建及优化，可实现含锰离子酶蛋白的高效可溶且有活性的表达，相比传统方法效率高、纯化工艺简单、成本低，有利于含锰离子酶的工业化生产和应用。
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公开(公告)号：CN109022471A
公开(公告)日：2018-12-18
申请号：CN201810864547.4
申请日：2018-08-01
Applicant: 武汉康复得生物科技股份有限公司
IPC: C12N15/70 , C12N9/02 , C12Q1/26 , A61K38/44 , A61P19/06 , A61P13/12 , A61P13/04 , C02F3/34 , A23L29/00 , C02F101/34 , C02F103/28
CPC classification number: C12N15/70 , A23L29/06 , A61K38/44 , A61P13/04 , A61P13/12 , A61P19/06 , C02F3/342 , C02F2101/34 , C02F2103/28 , C12N9/0008 , C12Q1/26 , C12Y102/03004 , G01N2333/90203
Abstract: 本发明公开了生产草酸氧化酶的大肠杆菌表达系统、草酸氧化酶的生产方法及其应用。所述大肠杆菌表达系统中的重组表达质粒包含：草酸氧化酶基因、分子伴侣基因和促进锰离子泵入大肠杆菌细胞相关蛋白的基因。本发明通过对不同的锰离子相关蛋白的基因及其拷贝数，控制分子伴侣表达的启动子种类，以及草酸氧化酶的生产过程所用的培养基种类进行筛选和测试，获得草酸氧化酶的优化表达组合，使得草酸氧化酶在大肠杆菌中的表达活力超过80U/mL。细胞破碎液上清初步纯化的草酸氧化酶的比活力大于20U/mg，单体分子量大小在25kDa左右。本发明技术方案具有生产和纯化工艺简单，表达量和比活力高，易于工业放大，成本低，有利于这类酶的工业化生产和应用等优势。
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