公开(公告)号：CN116121308B

公开(公告)日：2024-07-26

申请号：CN202310255061.1

申请日：2023-03-16

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  马倩 ,  郑灵洁 ,  郭强 ,  郑辉东

IPC: C12P7/26 ,  C12N15/53 ,  C12N15/54 ,  C12N9/10 ,  C12N9/02 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供了一种基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法，旨在通过体外级联酶催化技术将姜黄素高效转化为四氢姜黄素。本发明利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞，表达NADPH依赖性姜黄素转化酶（CurA）以及甲酸脱氢酶（Fdh）。使用LB培养基进行发酵，超声细胞破碎以得到CurA和Fdh的粗酶液。NADPH依赖性的CurA负责将姜黄素转化为四氢姜黄素。Fdh负责将产生的NADP+还原为NADPH以实现NADPH辅因子的高效循环利用。此外，借助离子液体提高姜黄素在反应体系中的溶解度，通过底物以及离子液体浓度的优化最终姜黄素转化率约为40.5%，四氢姜黄素产率约为48.66%，产量约为11.01mg/L。

公开(公告)号：CN118147188A

公开(公告)日：2024-06-07

申请号：CN202410381516.9

申请日：2024-03-29

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  刘宇轩 ,  郭强 ,  陈伟香 ,  郑辉东

IPC: C12N15/72 ,  C12N15/65 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供一种大肠杆菌T7表达系统的半安慰诱导方法，实现大肠杆菌以葡萄糖为主要碳源，并利用乳糖及其代谢产物为有效诱导物的基因线路。该方法以野生型E.coli BL21(DE3)为宿主，借助组成型启动子pdc过表达非特异性糖转运通道基因secY(ΔP),secE,secG,sCVE和乳糖异构酶基因lacZ，构建不受葡萄糖CCR效应影响的乳糖转运及分解途径；随后，利用葡萄糖CCR效应遏制半乳糖激酶基因galk表达，阻断半乳糖磷酸化的下游代谢途径，形成诱导物半乳糖的稳定积累；最后，通过检测T7启动子控制下绿色荧光蛋白GFP的荧光强度，实现对该系统中乳糖及其代谢产物诱导效果的验证。

公开(公告)号：CN118127097A

公开(公告)日：2024-06-04

申请号：CN202410361288.9

申请日：2024-03-27

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  章梦军 ,  郭强 ,  郑灵洁 ,  郑辉东

IPC: C12P19/02 ,  C12N15/53 ,  C12N15/54 ,  C12N15/55 ,  C12N15/61 ,  C12N15/31 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19

Abstract: 一种重组大肠杆菌利用葡萄糖发酵生产D‑阿洛糖的方法，以E.coli JM109(DE3)为宿主，通过引入pgi、rpiB、alsE、a6PP基因，构建从葡萄糖到D‑阿洛糖的生物合成途径；随后，通过敲除UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因galE，阻断副产物途径。在此基础上，敲除D‑阿洛糖特异性转运蛋白基因alsABC和D‑阿洛糖激酶基因alsK，阻断D‑阿洛糖的胞内代谢；最后，敲除磷酸戊糖途径中的葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶基因zwf以及糖酵解途径中的6‑磷酸果糖激酶基因pfkA，调节细胞的碳通量。通过上述技术手段，得到细胞工厂E.coli(Pgi,RpiB,AlsE,A6PP,ΔGalE,ΔAlsABC,ΔAlsK,ΔZwf,ΔPfkA)进行发酵，最终实现D‑阿洛糖的生物制备并且使其产量达到0.86g/L。

公开(公告)号：CN119842839A

公开(公告)日：2025-04-18

申请号：CN202510107024.5

申请日：2025-01-23

Applicant: 福州大学

Inventor： 范立海 ,  徐俊杰 ,  郭强

IPC: C12P19/02 ,  C12N15/70 ,  C12N15/61 ,  C12N15/62 ,  C12N9/90 ,  C12N15/55 ,  C12N15/54 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明属于大肠杆菌代谢过程领域，具体涉及一种大肠杆菌利用葡萄糖发酵产D‑阿洛酮糖的方法。以大肠杆菌为底盘宿主菌，同时过表达pgi基因、SUMO‑alsE融合基因和a6PP基因，再依次敲除pfkA基因、pfkB基因和rpiA基因，得能利用葡萄糖发酵生产D‑阿洛酮糖的重组菌；采用所述重组菌进行发酵，转化葡萄糖生成D‑阿洛酮糖。

公开(公告)号：CN116355935A

公开(公告)日：2023-06-30

申请号：CN202310347809.0

申请日：2023-04-04

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  程英凯 ,  郭强 ,  郑灵洁 ,  郑辉东

IPC: C12N15/70 ,  C12N15/66 ,  C12N15/56 ,  C12N15/31 ,  C12N15/50 ,  C12N15/10 ,  C12P19/12

Abstract: 本发明提供一种大肠杆菌利用SecY蛋白转位通道突变体跨膜转运蔗糖的方法。首先在大肠杆菌中过表达Klebsiella pneumoniae来源的scrB基因，从而完成构建细胞内的蔗糖水解途径；然后过表达SecY(ΔP)蛋白转位通道基因secY(ΔP),secE,secG以及SARS病毒来源的细胞外膜致孔蛋白基因sCVE，初步建立蔗糖跨膜运输通道；最后借助迭代饱和诱变的方法，使用定点随机突变的手段对基因secY(ΔP)进行改造，以调整SecY(ΔP)蛋白转位通道关键基因元件secY(ΔP)的氨基酸孔环开放程度，获得多种突变体菌株；使用发酵的方法对多种突变体菌株进行筛选，得到一株代谢蔗糖的优势菌株E.coli B3。

公开(公告)号：CN115466758A

公开(公告)日：2022-12-13

申请号：CN202211129170.0

申请日：2022-09-16

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  刘美茗 ,  郭强 ,  郑辉东

IPC: C12P19/02 ,  C12N15/70 ,  C12N15/53 ,  C12N15/54 ,  C12N15/55 ,  C12N15/60 ,  C12N15/61 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供一种大肠杆菌利用甲醇和D‑木糖发酵生产D‑阿洛酮糖的方法，利用大肠杆菌为宿主细胞，通过在野生大肠杆菌中表达外源基因甲醇脱氢酶Mdh、3‑己糖‑6‑磷酸合成酶Hps、6‑磷酸‑3‑己糖异构酶Phi、D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸差向异构酶AlsE、D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸磷酸酶A6PP，建立一条从甲醇和D‑木糖到合成D‑阿洛酮糖的路径。为提高AlsE蛋白的表达量引入蛋白标签SUMO。通过敲除副产物途径基因frmABR，磷酸戊糖途径的关键基因rpiA，以及糖酵解途径的关键基因pfkA，pfkB，得到一株重组菌株，实现碳源的理性控制，从而实现大肠杆菌利用甲醇和D‑木糖高效合成D‑阿洛酮糖。

公开(公告)号：CN118127098A

公开(公告)日：2024-06-04

申请号：CN202410361338.3

申请日：2024-03-27

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  董振兴 ,  郭强 ,  郑灵洁 ,  郑辉东

IPC: C12P19/02 ,  C12N15/54 ,  C12N15/55 ,  C12N15/60 ,  C12N15/61 ,  C12N15/31 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供一种重组大肠杆菌以甘油为底物生产D‑阿洛酮糖的方法。以大肠杆菌为底盘宿主菌，通过过表达果糖‑1，6‑二磷酸醛缩酶基因fbaA、果糖‑1，6‑二磷酸磷酸酶基因fbp、D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸差向异构酶基因alsE、D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸磷酸酶基因a6PP，构建从甘油合成D‑阿洛酮糖的途径；进一步敲除D‑果糖‑6‑磷酸激酶基因pfkA和pfkB、6‑磷酸葡萄糖异构酶基因pgi、UDP‑葡萄糖4‑差向异构酶基因galE以及D‑阿洛酮糖内转运蛋白关键基因fryA，优化甘油合成D‑阿洛酮糖的路径，提高转化效率。

公开(公告)号：CN115074376B

公开(公告)日：2023-11-14

申请号：CN202210459067.6

申请日：2022-04-28

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  刘晨阳 ,  郭强 ,  郑辉东

IPC: C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P19/02 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供了一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成D‑阿洛酮糖的方法。以大肠杆菌为底盘宿主菌，通过敲除果糖特异性PTS转移蛋白基因FruA，同时过表达果糖非磷酸化转运蛋白基因pstG‑F、果糖激酶基因maK、D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸差向异构酶基因alsE、阿洛酮糖‑6‑磷酸磷酸酶基因a6PP，建立从D‑果糖到D‑阿洛酮糖的合成途径；进一步敲除D‑果糖‑6‑磷酸激酶基因pfkA和pfkB，调控重组大肠杆菌的碳代谢通量；再过表达磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pckA并以甘油为碳源，提高胞内ATP浓度。本发明构建的重组大肠杆菌用于发酵生产，可有效提高底物转化率，为生物合成D‑阿洛酮糖的工业化发展提供优化方案。

公开(公告)号：CN115466758B

公开(公告)日：2024-12-06

申请号：CN202211129170.0

申请日：2022-09-16

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  刘美茗 ,  郭强 ,  郑辉东

IPC: C12P19/02 ,  C12N15/70 ,  C12N15/53 ,  C12N15/54 ,  C12N15/55 ,  C12N15/60 ,  C12N15/61 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供一种大肠杆菌利用甲醇和D‑木糖发酵生产D‑阿洛酮糖的方法，利用大肠杆菌为宿主细胞，通过在野生大肠杆菌中表达外源基因甲醇脱氢酶Mdh、3‑己糖‑6‑磷酸合成酶Hps、6‑磷酸‑3‑己糖异构酶Phi、D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸差向异构酶AlsE、D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸磷酸酶A6PP，建立一条从甲醇和D‑木糖到合成D‑阿洛酮糖的路径。为提高AlsE蛋白的表达量引入蛋白标签SUMO。通过敲除副产物途径基因frmABR，磷酸戊糖途径的关键基因rpiA，以及糖酵解途径的关键基因pfkA，pfkB，得到一株重组菌株，实现碳源的理性控制，从而实现大肠杆菌利用甲醇和D‑木糖高效合成D‑阿洛酮糖。

公开(公告)号：CN118127093A

公开(公告)日：2024-06-04

申请号：CN202410361286.X

申请日：2024-03-27

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  王培 ,  郭强 ,  郑灵洁 ,  郑辉东

IPC: C12P17/10 ,  C12N1/21 ,  C12N15/53 ,  C12N15/54 ,  C12N15/60 ,  C12N15/70 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供了一种利用大肠杆菌细胞工厂发酵合成麦角硫因的方法，旨在构建以甲硫氨酸、组氨酸和半胱氨酸为底物的新型大肠杆菌细胞工厂，实现麦角硫因的发酵合成。首先，以E.coli BL21(DE3)为宿主，利用pRSFDuet‑1和pACYCDuet‑1双质粒系统共表达组氨酸甜菜碱加氧酶（EgtB）、组氨酸N‑α‑甲基转移酶（EgtD）、半胱氨酸亚砜裂解酶（EgtE）、和S‑腺苷甲硫氨酸合成酶（MetK），构建麦角硫因的胞内合成途径；其次，依次对IPTG的量、温度、底物浓度发酵工艺进行优化，进一步强化细胞工厂的生产效率；最后，利用SUMO融合标签提高关键基因的表达水平，最终麦角硫因产量可达到81.9 mg/L。