公开(公告)号：KR1020000019366A

公开(公告)日：2000-04-06

申请号：KR1019980037413

申请日：1998-09-10

Applicant: 한국과학기술연구원

Inventor： 신용철 ,  반재구 ,  염도영

IPC: C12N15/53

CPC classification number: C12N9/0004 ,  C07K14/24 ,  C12N15/70

Abstract: PURPOSE: Nucleotide sequence of membrane bound 2-keto-D-gluconate dehydrogenase gene from Erwinia herbicola is determined and used for bio transformation of 2-keto-D-gluconate into 2,5-diketo-D-gluconate. 2,5-diketo-D-gluconate is an intermediate to produce vitamin C and pharmaceutics CONSTITUTION: Nucleotide sequence of membrane bound 2-keto-D-glaciate dehydrogenate is determined and bio transformation of 2-keto-D-gluconate into 2,5-diketo-D-gluconate is achieved by the recombinant enzyme introduced into other bacteria lacking of cytoplasm metabolic pathway of it. Membrane-bound 2-keto-D-gluconate dehydrogenase gene from Erwinia herbicola ATCC 08111 is isolated from cosmid library and sub cloned into PSTV28 for sequencing. The 2-keto-D-gluconate dehydrogenase gene is cloned into pKI111 and transformed into E. coli. The recombinant E.coli is cultured in LB media containing 2-keto-D-gluconate for 24hrs. Bio transformation takes place at per plasma of E.coli and conversion reaction is very fast.

Abstract translation: 目的：确定来自欧文氏菌除草剂的膜结合的2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶基因的核苷酸序列，并用于将2-酮-D-葡萄糖酸盐生物转化为2,5-二酮-D-葡萄糖酸盐。 2,5-diketo-D-葡萄糖酸盐是生产维生素C和药物的中间体构成：测定膜结合的2-酮-D-冰醋酸脱氢酶的核苷酸序列，并将2-酮-D-葡萄糖酸盐的生物转化为2,5 通过将重组酶引入缺乏其细胞质代谢途径的其他细菌中实现D-二酮-D-葡萄糖酸盐。 从柯氏假丝酵母ATCC 08111的膜结合的2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶基因从粘粒文库中分离，并将其亚克隆到PSTV28进行测序。 将2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶基因克隆到pKI111中并转化到大肠杆菌中。 将重组大肠杆菌在含有2-酮-D-葡萄糖酸盐的LB培养基中培养24小时。 生物转化发生在大肠杆菌的每个血浆，转化反应非常快。

公开(公告)号：KR100257117B1

公开(公告)日：2000-05-15

申请号：KR1019970048802

申请日：1997-09-25

Applicant: 한국과학기술연구원

Inventor： 반재구 ,  이홍원 ,  염도영

IPC: C12N15/52

CPC classification number: C12N9/0006

Abstract: PURPOSE: A membrane bound gluconate dehydrogenase, its gene, and a method for producing 2-keto-D-gluconate using transformed recombinant E. coli are provided, thereby the 2-keto-D-gluconate can be converted from gluconate in higher yield. CONSTITUTION: It is revealed that the membrane bound gluconate dehydrogenase derived from Erwinia cypripedii consists of 65 kDa of first subunit, 45 kDa of second subunit and 20 kDa of third subunit, by SDS-polyacrylamide analysis, in which the amino terminal of the first subunit has the amino acid sequence of formula (I) of Ala-Asn-Glu-Leu-Lys-Lys-Lys-Val-Asp-Ala-Val-Val-Val-Gly-Phe-Gly, the amino terminal of the second subunit has the amino acid sequence of formula(II) of Asp-Asp-Gln-Ala-Asn-Asp-Ala-Leu-Val, the amino terminal of the third subunit has the amino acid sequence of formula (III) of Ala-Glu-Glu-Ser-Ser-Gly-Ser-Gln-Thr-Ala-Arg-Asp-Tyr-Gln-Pro, flavo adenine dinucleotide bond region of the first subunit has the amino acid sequence of formula (IV) of Asp-X-X-X-X-Gly-X-Gly-X-X-Gly-X-X-X-Ala-X-X-Leu-X-Glu-X-X-xX-X-X-Val-X-X-Glu-X-Gly, and heme bonds of the second subunit has the amino acid sequence of formula (V) of Cys-X-Y-Cys-His. The recombinant E. coli JM109(pGA313)(KCTC 8823BP) is produced by transforming with a vector pGA313 containing the membrane bound gluconate dehydrogenase, and 2-keto-D-gluconate is produced by incubating the recombinant E. coli JM109(pGA313)(KCTC 8823BP).

Abstract translation: 目的：提供膜结合的葡萄糖酸脱氢酶，其基因和使用转化的重组大肠杆菌生产2-酮-D-葡萄糖酸盐的方法，从而可以更高的产率将2-酮-D-葡萄糖酸盐从葡萄糖酸盐转化。 结论：通过SDS-聚丙烯酰胺分析，揭示了来自欧文氏卷曲酵母的膜结合的葡萄糖酸脱氢酶由第一个亚基65kDa，第二个亚基45kDa，第三个亚基20kDa组成，其中第一个亚基的氨基末端 具有Ala-Asn-Glu-Leu-Lys-Lys-Lys-Val-Asp-Ala-Val-Val-Val-Gly-Phe-Gly的式（I）的氨基酸序列，第二亚基的氨基末端 具有Asp-Asp-Gln-Ala-Asn-Asp-Ala-Leu-Val的式（II）的氨基酸序列，第三亚基的氨基末端具有式（III）的氨基酸序列的Ala-Glu -Glu-Ser-Ser-Gly-Ser-Gln-Thr-Ala-Arg-Asp-Tyr-Gln-Pro，第一亚基的黄素腺嘌呤二核苷酸键区具有Asp-XXXX的式（IV）的氨基酸序列 -Gly-X-Gly-XX-Gly-XXX-Ala-XX-Leu-X-Glu-XX-xX-XX-Val-XX-Glu-X-Gly，第二亚基的血红素键具有氨基酸 Cys-XY-Cys-His的式（Ⅴ）序列。 通过用含有膜结合的葡萄糖酸脱氢酶的载体pGA313转化来产生重组大肠杆菌JM109（pGA313）（KCTC8823BP），通过温育重组大肠杆菌JM109（pGA313）（pGA313）产生2-酮-D-葡萄糖酸 KCTC 8823BP）。

公开(公告)号：KR1019990085427A

公开(公告)日：1999-12-06

申请号：KR1019980017832

申请日：1998-05-18

Applicant: 한국과학기술연구원

Inventor： 염도영 ,  이봉용 ,  반재구

IPC: C12N15/53 ,  C12N1/21

Abstract: 본 발명은 대장균으로부터 분리한 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소(2,5-diketo-D-gluconate reductase) 유전자 및 이 유전자에 의해 재조합된 재조합 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소에 관한 것이다.
본 발명은 대장균으로부터 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소의 유전자인 yqhE 유전자를 분리하고 이 유전자중 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소의 단백질만을 코딩하는 유전자를 플라스미드에 삽입하여 재조합 플라스미드 pTY-YQH를 제조하였으며 이 재조합 플라스미드로 대장균 DH5α를 형절전환시켜 대장균 ER2566(pTY-TQH)를 얻은 후 이 형질전환된 대장균 ER2566(pTY-TQH)을 배양하여 재조합 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소를 대량생산하는 뛰어난 효과가 있다.

公开(公告)号：KR1019990026601A

公开(公告)日：1999-04-15

申请号：KR1019970048802

申请日：1997-09-25

Applicant: 한국과학기술연구원

Inventor： 반재구 ,  이홍원 ,  염도영

IPC: C12N15/52

Abstract: 본 발명은 어위니아 시프리페디(Erwinia Cypripedii)로 부터 글루코네이트를 2-케토-디-글루코네이트로 전환하는 세포막결합 글루코네이트 탈수소효소(gluconate dehydrogenase), 글루코네이트탈수소 유전자 및 염기서열과 이 유전자를 함유하는 형질전환된 재조합 대장균을 이용하여 글루코네이트의 2-케토-디-글루코네이트로의 전환하는 방법을 제공한다.

公开(公告)号：KR100320784B1

公开(公告)日：2002-05-13

申请号：KR1019980037413

申请日：1998-09-10

Applicant: 한국과학기술연구원

Inventor： 신용철 ,  반재구 ,  염도영

IPC: C12N15/53

Abstract: 본 발명은 어위니아 허비콜라(Erwinia herbicola) 균주로부터 분리한 세포막결합 2-케토-디-글루코네이트 탈수소효소(2-keto-D-gluconate dehydrogenase) 유전자 염기서열 및 이 유전자를 세포내 대사과정이 없는 다른 균주에 도입하여 배양하므로써 재조합 2-케토-디-글루코네이트 탈수소효소에 의해 2-케토-디-글루코네이트(2-keto-D-gluconate)를 2,5-다이케토-디-글루코네이트(2,5-diketo-D-gluconate)로 전환하는 방법에 관한 것으로 상기 어위니아 허비콜라 ATCC 08111 균주로부터 세포막결합 2-케토-디-글루코네이트 탈수소효소 유전자를 클로닝 및 서브클로닝하여 세포막결합 2-케토-디-글루코네이트 탈수소효소 유전자 염기서열을 결정한 후 이 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드 pKI111를 대장균에 도입하므로써 대장균을 형질전환시킨 후 배양하여 형질전환된 대장균내에서 세� �막결합 2-케토-디-글루코네이트 탈수소효소 유전자를 발현시키므로써 재조합 세포막결합 2-케토-디-글루코네이트 탈수소효소 활성에 의해 2-케토-디-글루코네이트를 2,5-다이케토-디-글루코네이트로 세포내 대사분해 없이 신속하게 전환할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

公开(公告)号：KR100320370B1

公开(公告)日：2002-03-21

申请号：KR1019980039405

申请日：1998-09-23

Applicant: 한국과학기술연구원

Inventor： 염도영 ,  이봉용 ,  함대현 ,  반재구

IPC: C12N15/53

Abstract: 본 발명은 신규한 대장균 유래 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소(2,5-diketo-D-gluconate reductase)의 유전자 염기서열을 결정하고 이들 효소들의 유전자를 결손시켜 포도당 대사에 의한 비타민 C 제조시 중간산물의 세포내 대사를 저해하여 고수율로 비타민 C 전구체인 2-케토-엘-글로네이트(2-keto-L-gulonate) 생산에 관한 것으로 대장균으로부터 코리네박테리움 속(corynebacterium sp.) 미생물의 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소와 글루코노박터 옥시단스(gluconobacter oxydans)의 5-케토-디-글루코네이트 환원효소의 아미노산 배열과 유사성을 보이는 단백질의 유전자인
yqhE ,
yafB 및
yjgU 를 클로닝한 후 이들 유전자 산물의 효소 단백질을 정제한 후 효소활성을 측정하여 상기
yqhE 유전자는 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소를 코� �하고
yafB 유전자는 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소를 코딩하며
yjgU 유전자는 5-케토-디-글루코네이트 환원효소를 코딩하는 유전자임을 검증하므로써
yqhE 유전자,
yafB 유전자 및
yjgU 가 각기 코딩하는 대장균으로부터 유래된 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소, 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소 및 5-케토-디-글루코네이트 환원효소의 존재를 확인하고 이들 효소의 대사경로에 기초하여 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소의 유전자인
yafB 유전자를 결손시키므로써 대장균내 생물전환에 의한 2-케토-엘-글로네이트의 생산시에 중간산물인 2,5-다이케토-디-글루코네이트의 세포내 대사를 방지하여 비타민 C 전구체인 2-케토-엘-글로네이트의 생산수� �을 향상시키는 뛰어난 효과가 있다.

公开(公告)号：KR1020000020688A

公开(公告)日：2000-04-15

申请号：KR1019980039405

申请日：1998-09-23

Applicant: 한국과학기술연구원

Inventor： 염도영 ,  이봉용 ,  함대현 ,  반재구

IPC: C12N15/53

CPC classification number: C12N9/0012 ,  C12N15/70

Abstract: PURPOSE: A yafB gene that is a gene for 2-keto-D-gluconate producing 2,5-diketo-D-gluconate reductase is defected to prevent metabolism of 2,5-diketo-D-gluconate produced as an intermediate product in the production of 2-keto-L-glonate by transformation in E. coli, thereby production yield of 2-keto-L-glonate as a precursor of vitamin C is enhanced. CONSTITUTION: The yafB gene codes the 2,5-diketo-gluconate reductase gene for production of 2-keto-D-gluconate, which is originated from E. coli. The yafB gene is inserted into a recombinant plasmid pYAFB. The recombinant plasmid pYAFB with the yafB gene inserted thereinto is transformed in a coliform DH5alpha/pYAFB (KCTC 0509BP). In the production of 2-keto-L-glonate as a precursor of vitamin C from gluconate by glucose metabolism, the 2,5-diketo-D-gluconate reductive defective gene is introduced to a host cell to express a glucose reductive in a membrane-bound recombinant strain.

Abstract translation: 目的：作为2-酮-D-葡萄糖酸盐产生2,5-二酮-D-葡萄糖酸还原酶的基因的yafB基因被缺陷以防止作为中间产物产生的2,5-二酮-D-葡萄糖酸盐的代谢 通过在大肠杆菌中转化生产2-酮-L-聚糖，从而提高作为维生素C前体的2-酮-L-聚乙二醇的产率。 构成：yafB基因编码2,5-diketo葡萄糖酸还原酶基因，用于生产来源于大肠杆菌的2-酮-D-葡萄糖酸盐。 将yafB基因插入重组质粒pYAFB中。 将含有yafB基因的重组质粒pYAFB转化到大肠杆菌DH5α/ pYAFB（KCTC 0509BP）中。 在通过葡萄糖代谢产生作为葡萄糖酸的维生素C的前体的2-酮-L-聚乙二醇化时，将2,5-二酮-D-葡萄糖酸还原性缺陷基因导入宿主细胞，以在膜中表达葡萄糖还原 重组菌株。

公开(公告)号：KR100320371B1

公开(公告)日：2002-04-22

申请号：KR1019980017832

申请日：1998-05-18

Applicant: 한국과학기술연구원

Inventor： 염도영 ,  이봉용 ,  반재구

IPC: C12N15/53 ,  C12N1/21

Abstract: 본 발명은 대장균으로부터 분리한 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소 (2,5-diketo-D-gluconate reductase) 유전자 및 이 유전자와 형질전환된 대장균을 이용한 2-케토-엘-글로네이트의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 대장균으로부터 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소의 유전자인 yqhE 유전자를 분리하고 이 유전자중 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소의 단백질만을 코딩하는 유전자를 플라스미드에 삽입하여 재조합 플라스미드 pTY-YQH를 제조하였으며 이 재조합 플라스미드로 대장균 DH5α를 형절전환시켜 대장균 ER2566(pTY-TQH)를 얻은 후 이 형질전환된 대장균 ER2566(pTY-TQH)을 배양하여 재조합 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소를 대량생산하는 뛰어난 효과가 있다.

公开(公告)号：KR100320269B1

公开(公告)日：2002-04-22

申请号：KR1019980039404

申请日：1998-09-23

Applicant: 한국과학기술연구원

Inventor： 염도영 ,  이봉용 ,  함대현 ,  반재구

IPC: C12N15/53

Abstract: 본 발명은 신규한 대장균 유래 2-케토알도네이트 환원효소(2-ketoaldonate reductase)의 유전자 염기서열을 결정하고 이들 효소들의 유전자를 결손시켜 포도당 대사에 의한 비타민 C 제조시 중간산물의 세포내 대사를 저해하여 고수율로 비타민 C 전구체인 2-케토-엘-글로네이트(2-keto-L-gulonate) 생산에 관한 것으로 대장균으로부터 포스포그라이세레이트 탈수소효소(phosphoglycerate dehydrogenase)및 하이드록시피루베이트 환원효소(hydropyruvate reductase)와 유사성을 보이는
yiaE 유전자를 PCR 클로닝하고 클로닝한
yiaE 유전자의 효소 단백질 산물의 기질 특이성을 조사하여
yiaE 유전자가 2-케토알도네이트 환원효소를 코딩하는 유전자임을 검증하고 이 유전자의 염기서열을 결정한 후 상기 검증한 2-케토알도네이트 환원효소를 코딩하는
yiaE 유전자를 결손시킨 다음 대장균에 � ��입하여 재조합 대장균내에서 발현되는 2-케토알도네이트 환원효소 활성을 측정한 결과,
yiaE 유전자가 결손된 2-케토알도네이트 환원효소는 대장균내 생물전환에 의한 2-케토-엘-글로네이트의 생산시에 중간산물인 2-케토-디-글루코네이트, 2,5-다이케토-디-글루코네이트 및 최종산물인 2-케토-엘-글로네이트의 세포내 대사를 방지하여 비타민 C 전구체인 2-케토-엘-글로네이트의 생산수율을 향상시키는 뛰어난 효과가 있다.

公开(公告)号：KR1020000020687A

公开(公告)日：2000-04-15

申请号：KR1019980039404

申请日：1998-09-23

Applicant: 한국과학기술연구원

Inventor： 염도영 ,  이봉용 ,  함대현 ,  반재구

IPC: C12N15/53

CPC classification number: C12N9/0004 ,  C07K14/24 ,  C12N15/70

Abstract: PURPOSE: A yiaE gene that is a gene for 2-ketoaldonate reductase is defected to prevent metabolism of 2-keto-D-gluconate, 2,5-diketo-D-gluconate and 2-keto-L-glonate produced in production of 2-keto-L-glonate by transformation in coli, thereby production yield of 2-keto-L-glonate as a precursor of vitamin C is enhanced. CONSTITUTION: The yiaE gene codes a 2-ketoaldonate reductase gene, which is originated from E. coli. The yiaE gene is inserted into a recombinant plasmid pHD2. The recombinant plasmid pHD2 with the yiaE gene inserted thereinto is transformed in a coliform DH5alpha/pHD2 (KCTC 0507BP). In the production of 2-keto-L-glonate as a precursor of vitamin C from gluconate by glucose metabolism, the 2-ketoaldonate reductive defective gene is introduced to a host cell to express a glucose reductive in a membrane-bound recombinant strain.

Abstract translation: 目的：作为2-酮戊二醛还原酶基因的yiaE基因被缺陷，以防止2-酮-D-葡萄糖酸盐，2,5-二酮-D-葡萄糖酸盐和2-酮-L-葡萄糖酸盐的生成中产生的2-keto-L- 通过在大肠杆菌中转化，从而提高了作为维生素C前体的2-酮-L-聚乙二醇的产率。 构成：yiaE基因编码源自大肠杆菌的2-酮戊二醛还原酶基因。 将yiaE基因插入重组质粒pHD2中。 将插入有yiaE基因的重组质粒pHD2转化大肠杆菌DH5α/ pHD2（KCTC 0507BP）。 在通过葡萄糖代谢产生作为葡萄糖酸的维生素C的前体的2-酮-L-聚乙二醇化时，将2-酮戊二醛还原性缺陷基因导入宿主细胞，以在膜结合的重组菌株中表达葡萄糖还原。