公开(公告)号：KR1020060021161A

公开(公告)日：2006-03-07

申请号：KR1020040070017

申请日：2004-09-02

Applicant: 한국과학기술원

Inventor： 김선창 ,  이충훈 ,  임보람 ,  성봉현 ,  유병조 ,  이원식 ,  이준형 ,  이상희

IPC: C12N15/11 ,  C12N15/63 ,  C12N1/21

CPC classification number: C12N15/70 ,  C12N15/52

Abstract: 본 발명은 항생제 민감도와 생산물 분비 효율 및 형질전환 효율이 증가된 대장균 변이주에 관한 것으로, 상기 변이주는 생물막(biofilm)의 형성이 억제되어, 생물막에 의한 항생제와 분비물 및 외래 유전자에 대한 확산의 저해가 최소화된 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의하여, 대장균의 유전자 조작 실험 도중의 변이주 선별 과정에 있어서, 보다 적은 양의 항생제로 원하는 변이주를 선별할 수 있고, 선별하고자 하는 변이주가 아닌 균주가 생물막을 형성하여 항생제에 내성을 보여서 선별의 효율을 떨어뜨리는 것을 방지할 수 있다. 또한, 분비물의 확산 효율이 증가됨으로써 배지 내로 분비되는 생산물의 수득률을 증가시킬 수 있다. 그리고 형질전환 효율이 증가됨으로써 유용 물질의 대량생산을 보다 용이하게 할 수 있다.

Abstract translation: 本发明是对抗生素的敏感性和产物分泌效率和转化效率是在大肠杆菌（E.coli）突变体菌株，其中所述突变是生物膜（生物膜）的形成被抑制，抗生素扩散放电和所述外源基因的抑制生物膜被增加 被最小化。 根据本发明，大肠杆菌的遗传修饰实验期间的突变体的筛选方法，和更可被选择用于与抗生素的少量所需的突变体，在非突变体菌株boyeoseo耐进行筛选，以抗生素和形成生物膜筛选 可以防止电池效率的降低。 另外，可以增加分泌物的扩散效率，从而增加分泌到培养基中的产物的产量。 通过提高转化效率，可以促进有用物质的大规模生产。

公开(公告)号：KR1020040036371A

公开(公告)日：2004-04-30

申请号：KR1020020065351

申请日：2002-10-24

Applicant: 한국과학기술원

Inventor： 김선창 ,  이원식 ,  유병조 ,  성봉현 ,  김정민 ,  이충훈 ,  이준형

IPC: C12N15/31

CPC classification number: C07K14/245 ,  C12N15/1031 ,  C12N15/70

Abstract: PURPOSE: A linear DNA fragment for developing a mutated microorganism of which specific region in chromosome is removed and a method for preparing the same microorganism are provided, thereby completely removing selection marker and foreign DNA from the chromosome. CONSTITUTION: A linear DNA fragment for developing a mutated microorganism of which specific region in chromosome is removed comprises 500 bp homologous domains A and C which is homologous to the both ends of the chromosome to be removed and related to the lambda-red recombination when this linear DNA fragment is inserted into the both ends of microorganism; 500 bp homologous domain B which is homologous to a region adjacent to one end of the chromosome to be removed and related to the homologous recombination when a selection marker at one end is removed; sacB gene having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 as a factor for confirming the selection marker and selection marker removement; and the restriction enzyme I-SceI recognition site having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 related to the homologous recombination for removing the selection marker.

Abstract translation: 目的：提供用于开发除去染色体中特定区域的突变微生物的线性DNA片段和制备相同微生物的方法，从而从染色体中完全去除选择标记和外来DNA。 构成：用于开发其中去除染色体中特定区域的突变微生物的线性DNA片段包含500bp同源结构域A和C，其与要去除的染色体的两端同源且与λ-红色重组有关 将线性DNA片段插入微生物的两端; 500bp同源结构域B，其与待去除的染色体的一端相邻的区域同源，并且在一端的选择标记被去除时与同源重组相关; 具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的sacB基因作为确认选择标记和选择标记移除的因子; 以及具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的限制酶I-SceI识别位点与用于除去选择标记的同源重组相关。

公开(公告)号：KR1020030069708A

公开(公告)日：2003-08-27

申请号：KR1020020009647

申请日：2002-02-22

Applicant: 한국과학기술원

Inventor： 김선창 ,  유병조

IPC: C12N15/63

CPC classification number: C12N15/63 ,  C12N15/90

Abstract: PURPOSE: A method for preparing microorganism mutant strains in which a specific chromosome is removed using transposon and Cre/loxP site-specific recombination is provided, thereby effectively removing specific portions of chromosome from microorganisms. CONSTITUTION: A transposon TnKGloxP comprises a transposase recognition site having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in one end, another transposase recognition site having the nucleotide sequence complementary with the SEQ ID NO: 3 in another end, loxp region having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, KmR gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and GFP gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6. A transposon TnCloxP comprises a transposase recognition site having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in one end, another transposase recognition site having the nucleotide sequence complementary with the SEQ ID NO: 3 in another end, loxP region having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 and CmR gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7. A method for preparing microorganism mutant strains in which a specific chromosome is removed using transposon and Cre/loxP site-specific recombination comprises the steps of: preparing two transposons having different selection markers; inserting two transposons into each chromosome of each microorganism; positioning transposons on a chromosome using P1 phage transduction; and inserting a Cre gene into the chromosome, and expressing the Cre gene to a portion of chromosome between two loxP regions.

Abstract translation: 目的：提供使用转座子和Cre / loxP位点特异性重组来除去特异性染色体的微生物突变菌株的方法，从而有效地从微生物中除去染色体的特定部分。 构成：转座子TnKGloxP包含在一端具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的转座酶识别位点，另一端具有与SEQ ID NO：3互补的核苷酸序列的另一转座识别位点，具有核苷酸序列的loxp区 具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的KmR基因和具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列的GFP基因。转座子TnCloxP包含具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列的转座子识别位点。 在另一端具有与SEQ ID NO：3互补的核苷酸序列的另一个转座酶识别位点，具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列的loxP区域和具有SEQ ID NO：7的核苷酸序列的CmR基因 制备使用转座子和Cre / loxP位点特异性重组除去特异性染色体的微生物突变菌株的方法包括以下步骤：制备两个转座子havi 不同的选择标记; 将两个转座子插入每个微生物的每个染色体中; 使用P1噬菌体转导在染色体上定位转座子; 并将Cre基因插入染色体，并将Cre基因表达到两个loxP区域之间的一部分染色体。

公开(公告)号：KR100958096B1

公开(公告)日：2010-05-14

申请号：KR1020080012377

申请日：2008-02-11

Applicant: 한국과학기술원

Inventor： 김선창 ,  강귀현 ,  유병조 ,  이준형 ,  성봉현 ,  이충훈 ,  이상희 ,  이주영 ,  박명근

IPC: C12N15/66 ,  C12N15/64 ,  C12N15/09

CPC classification number: C12N15/102 ,  C12N15/70 ,  C12N15/902 ,  C12N2800/80 ,  C12N2830/002

Abstract: 본 발명은 염색체 특정 부위 제거용 재조합 벡터 및 이를 이용한 미생물 내 염색체 특정 부위의 제거방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 아라비노즈에 의해 유도되는 프로모터; 람다(λ)-레드(red) 재조합에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자; 람노즈에 의해 유도되는 프로모터; 및 I-
Sce I 제한효소를 코딩하는 유전자;를 포함하는, 염색체 특정 부위 제거용 재조합 벡터로, 기존 방법에 비해 보다 간편하고 빠르게, 선별마커를 남기지 않고, 미생물 내 특정 유전자를 연속적으로 제거할 수 있다.
유전자 제거, 람다-레드 재조합 (λ-red recombination), 람노즈, 아라비노즈, 유전체 재조합

公开(公告)号：KR1020090086870A

公开(公告)日：2009-08-14

申请号：KR1020080012377

申请日：2008-02-11

Applicant: 한국과학기술원

Inventor： 김선창 ,  강귀현 ,  유병조 ,  이준형 ,  성봉현 ,  이충훈 ,  이상희 ,  이주영 ,  박명근

IPC: C12N15/66 ,  C12N15/64 ,  C12N15/09

CPC classification number: C12N15/102 ,  C12N15/70 ,  C12N15/902 ,  C12N2800/80 ,  C12N2830/002

Abstract: A recombinant vector for removing a specific site of chromosome is provided to sequencially and simply remove the specific gene site in a microorganism at once. A recombinant vector for removing a specific site of chromosome comprises a promoter (Para) which is induced by arabinose; a gene which encodes a protein related to lamda-red recombination; and promoter which is induced by a rhamnose. A method for removing the specific site of the chromosome using the recombinant vector comprises: a step of preparing a linear DNA fragment having homologous site A and B which is related to lamda-red recombination, I-SceI restriction enzyme cutting site, and homologous site C which is related to homologous recombination for removing selection marker; a step of introducing linear DNA fragement in transformed microorganism and replacing at specific site of microorganism chromosome; and a step of expressing I-SceI restriction enzyme and removing selection marker.

Abstract translation: 提供了一种用于去除染色体特异性位点的重组载体，以便一次性地顺序并简单地除去微生物中的特异性基因位点。 用于去除染色体特异位点的重组载体包含由阿拉伯糖诱导的启动子（Para）; 编码与lamda-red重组相关的蛋白质的基因; 和由鼠李糖诱导的启动子。 使用重组载体去除染色体的特定位点的方法包括：制备与lamda-red重组，I-SceI限制酶切割位点和同源位点相关的具有同源位点A和B的线性DNA片段的步骤 C与同源重组相关，用于去除选择标记; 在转化的微生物中引入线性DNA分解并在微生物染色体的特定部位置换的步骤; 以及表达I-SceI限制酶并除去选择标记的步骤。

公开(公告)号：KR100470907B1

公开(公告)日：2005-03-08

申请号：KR1020020021811

申请日：2002-04-20

Applicant: 한국과학기술원

Inventor： 김선창 ,  성봉현 ,  유병조 ,  김정민 ,  이원식 ,  이충훈 ,  이준형

IPC: C12N15/00

CPC classification number: C12N15/1082 ,  C12N15/90

Abstract: 본 발명은 트랜스포존(transposon)의 분자내 전위(intramolecular trnaposition)와 선별마커(selection marker)를 이용한 염색체의 임의 부위의 제거에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 트랜스포존의 전위효소 인식부위(outer element, OE)와 선별마커(selection markers)를 포함하는 트랜스포존 및 상기 트랜스포존과 전위효소(transposase) 발현벡터를 미생물에 삽입시켜 미생물 염색체의 임의 부위를 양방향으로 제거함으로써, 주어진 생장조건 하에서 생장에 불필요한 유전자를 선별함과 동시에, 유전자 일부가 제거된 새로운 미생물 변이주를 제조하는 새로운 방법에 관한 것이다.

公开(公告)号：KR100459870B1

公开(公告)日：2004-12-04

申请号：KR1020020009647

申请日：2002-02-22

Applicant: 한국과학기술원

Inventor： 김선창 ,  유병조

IPC: C12N15/63

CPC classification number: C12N15/63 ,  C12N15/90

Abstract: Disclosed is a method for developing novel strains deleted specific chromosome sites, using transposon and Cre/loxP site-specific recombination by Cre expression vector, wherein the transposon comprises a selectable marker and loxP site. The method comprises the steps of: (1) preparing a transposon comprising a selectable marker and loxP site; (2) inserting the transposon into an optional position of microbial chromosome, and determining the inserted site; (3) integrating two transposons comprising a different selectable marker to one chromosome; (4) deleting a chromosomal site between the two lox sites by introducing a Cre expression vector into the chromosome of step (3); and (5) repeating steps (3 and 4) for the mutant deleted a part of chromosome, to shorten the chromosome of mutant gradually.

Abstract translation: 公开了一种开发利用由Cre表达载体进行的转座子和Cre / loxP位点特异性重组来删除特定染色体位点的新型菌株的方法，其中所述转座子包含选择标记和loxP位点。 该方法包括以下步骤：（1）制备包含选择标记和loxP位点的转座子; （2）将转座子插入微生物染色体的任选位置，并确定插入的位点; （3）将包含不同选择标记的两个转座子整合到一条染色体上; （4）通过将Cre表达载体导入步骤（3）的染色体中，从而删除两个lox位点之间的染色体位点; （5）重复步骤（3和4）中突变体缺失部分染色体，逐渐缩短突变体的染色体。

公开(公告)号：KR100585450B1

公开(公告)日：2006-06-07

申请号：KR1020040070017

申请日：2004-09-02

Applicant: 한국과학기술원

Inventor： 김선창 ,  이충훈 ,  임보람 ,  성봉현 ,  유병조 ,  이원식 ,  이준형 ,  이상희

IPC: C12N15/11 ,  C12N15/63 ,  C12N1/21

CPC classification number: C12N15/70 ,  C12N15/52

Abstract: 본 발명은 항생제 민감도와 생산물 분비 효율 및 형질전환 효율이 증가된 대장균 변이주에 관한 것으로, 상기 변이주는 생물막(biofilm)의 형성이 억제되어, 생물막에 의한 항생제와 분비물 및 외래 유전자에 대한 확산의 저해가 최소화된 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의하여, 대장균의 유전자 조작 실험 도중의 변이주 선별 과정에 있어서, 보다 적은 양의 항생제로 원하는 변이주를 선별할 수 있고, 선별하고자 하는 변이주가 아닌 균주가 생물막을 형성하여 항생제에 내성을 보여서 선별의 효율을 떨어뜨리는 것을 방지할 수 있다. 또한, 분비물의 확산 효율이 증가됨으로써 배지 내로 분비되는 생산물의 수득률을 증가시킬 수 있다. 그리고 형질전환 효율이 증가됨으로써 유용 물질의 대량생산을 보다 용이하게 할 수 있다.

公开(公告)号：KR100482274B1

公开(公告)日：2005-04-14

申请号：KR1020020065351

申请日：2002-10-24

Applicant: 한국과학기술원

Inventor： 김선창 ,  이원식 ,  유병조 ,  성봉현 ,  김정민 ,  이충훈 ,  이준형

IPC: C12N15/31

Abstract: 본 발명은 염색체의 특정부위가 제거된 미생물 변이주의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, sacB 유전자, I-sceI 제한효소 절제부위(restriction site), 선별마커(selectable marker) 및 미생물 염색체의 일부와 상동인 상동부위(homology arm)를 포함하는 선형 DNA 단편 및 이를 이용한 부위 특이적 동성 재조합(site specific homologous-recombination)에 의하여, 선별마커의 남김 없이 염색체의 특정부위를 제거함으로써, 새로운 미생물 변이주를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 상기와 같은 방법을 반복하여 순차적으로 특정 유전자들을 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

公开(公告)号：KR1020030083324A

公开(公告)日：2003-10-30

申请号：KR1020020021811

申请日：2002-04-20

Applicant: 한국과학기술원

Inventor： 김선창 ,  성봉현 ,  유병조 ,  김정민 ,  이원식 ,  이충훈 ,  이준형

IPC: C12N15/00

CPC classification number: C12N15/1082 ,  C12N15/90

Abstract: PURPOSE: A transposon for bidirectional intramolecular genome deletions, a construction of a microorganism mutant and the identification of nonessential genes using the same transposon are provided, thereby effectively constructing the nonessential gene-removed Escherichia coli mutant. CONSTITUTION: Transposon TnRIBD sequentially comprises Tn5 transposase recognition site having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; tetR gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4; Tnγδ transposase recognition site having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; CmR gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5; Tnγδ transposase recognition site having the reverse complementary nucleotide sequence with SEQ ID NO: 3; sacB gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6; and Tn5 transposase recognition site having the reverse complementary nucleotide sequence with SEQ ID NO: 2 in a direction of 5' to 3'. A construction method of a microorganism mutant comprises the steps of: constructing the transposon comprising the transposase recognition site and a selection marker; inserting the transposon into a certain site in the genome of a microorganism; and cloning a transposase expression vector into the genome of the microorganism to remove a portion of chromosome in both ends.

Abstract translation: 目的：提供用于双向分子内基因组缺失的转座子，构建微生物突变体和使用相同转座子鉴定非必需基因，从而有效构建非必需基因去除的大肠杆菌突变体。 构成：转座子TnRIBD依次包含具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的Tn5转座酶识别位点; 具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列的tetR基因; 具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的Tnγδ转座酶识别位点; 具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的CmR基因; 具有与SEQ ID NO：3相反的互补核苷酸序列的Tnγδ转座酶识别位点; 具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列的sacB基因; 和具有与SEQ ID NO：2相反的互补核苷酸序列的5'至3'的Tn5转座酶识别位点。 微生物突变体的构建方法包括以下步骤：构建包含转座酶识别位点和选择标记的转座子; 将转座子插入微生物基因组中的某个位点; 并将转座酶表达载体克隆到微生物的基因组中以去除两端染色体的一部分。