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公开(公告)号：CN101333537B
公开(公告)日：2011-02-02
申请号：CN200710069814.0
申请日：2007-06-29
Applicant: 浙江工业大学
Abstract: 本发明提供了一种可用于快速克隆和表达目的基因PCR产物的一种表达型前T载体，及其制备与应用。本发明的有益效果主要体现在：一步法使目的基因克隆并得到表达，省略复杂的重组过程；在构建过程中无需对PCR产物进行纯化、酶切，前T载体用XcmI单酶切即可得到线性化的T载体，酶切效率高，无需使用其他限制性内切酶参与；目的基因无需使用价格昂贵的IPTG诱导，可以低成本地进行大规模工程菌发酵；可在目的基因得到表达后再进行测序鉴定，将表达结果符合期望的转化子送DNA测序公司测序可以提高测序成功率，节约经费。
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公开(公告)号：CN101381739A
公开(公告)日：2009-03-11
申请号：CN200710071214.8
申请日：2007-09-06
Applicant: 浙江工业大学
IPC: C12N15/63
Abstract: 本发明提供了一种周质分泌融合表达型前T载体，由如下方法制备得到：(1)构建编码BspTI－GSGSG－HHHHHH－XcmI－Ampr－XcmI－HindIII的DNA1片段；(2)定点突变pET39质粒中LacI基因内部的三个XcmI位点，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39’；(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39’中，得到所述周质分泌融合表达型前T载体。本发明除了使用XcmI制备线形T载体外，不需要用其它限制性内切酶，一步法构建融合表达基因工程菌，为大量制备活性肽工程菌库提供了可行的技术方法。
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公开(公告)号：CN101333538A
公开(公告)日：2008-12-31
申请号：CN200710069815.5
申请日：2007-06-29
Applicant: 浙江工业大学
Abstract: 本发明提供了一种前T载体，由以下方法制备得到：(1)以含有氨苄青霉素除外的大肠杆菌敏感的抗生素的抗性基因的质粒为模板进行PCR扩增，在引物的5’末端引入Xcm I酶切位点，扩增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表达调控序列、两端含有Xcm I酶切位点的DNA片段；(2)用T4DNA连接酶将步骤(1)得到的DNA片段和pUCmT载体进行连接；(3)将步骤(2)所得连接产物转化大肠杆菌DH5α或JM109，筛选阳性克隆，即得所述前T载体。本发明的有益效果主要体现在：用本发明前T载体制备得到的载体可用于快速克隆PCR产物，筛选阳性克隆过程中不需要使用X－gal、阴性率低。
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公开(公告)号：CN101333537A
公开(公告)日：2008-12-31
申请号：CN200710069814.0
申请日：2007-06-29
Applicant: 浙江工业大学
Abstract: 本发明提供了一种可用于快速克隆和表达目的基因PCR产物的一种表达型前T载体，及其制备与应用。本发明的有益效果主要体现在：一步法使目的基因克隆并得到表达，省略复杂的重组过程；在构建过程中无需对PCR产物进行纯化、酶切，前T载体用XcmI单酶切即可得到线性化的T载体，酶切效率高，无需使用其他限制性内切酶参与；目的基因无需使用价格昂贵的IPTG诱导，可以低成本地进行大规模工程菌发酵；可在目的基因得到表达后再进行测序鉴定，将表达结果符合期望的转化子送DNA测序公司测序可以提高测序成功率，节约经费。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN101235084A
公开(公告)日：2008-08-06
申请号：CN200710067138.3
申请日：2007-01-31
Applicant: 浙江工业大学
IPC: C07K14/435 , C12N15/09 , C12N15/12 , C12N1/21 , C12P21/02
Abstract: 本发明提供了一种制备重组骨形态发生蛋白BMP－2成熟肽的方法：删除DsbA基因信号肽第2～18个氨基酸编码基因，保留第一个甲硫氨酸的密码子作为起始密码子，得到片段重组于表达载体中，获得的重组质粒1；将骨形态发生蛋白BMP－2完整成熟肽的DNA重组于重组质粒1中DsbA基因的下游，获得重组质粒2；将重组质粒2转化入表达宿主菌株的菌体中，得到工程菌经培养、添加诱导剂使目的基因表达，破菌、分离纯化得到DsbA－BMP－2融合蛋白，蛋白酶酶切DsbA－BMP－2融合蛋白，经分离得到所述的骨形态发生蛋白BMP－2成熟肽。本发明方法制得的产物可与天然BMP－2成熟肽氨基酸序列完全一致，实现可溶性胞内融合表达，融合蛋白可以用Ni2+亲和层析一步纯化，进一步简化了BMP－2复性前的纯化步骤。
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公开(公告)号：CN101381739B
公开(公告)日：2012-02-01
申请号：CN200710071214.8
申请日：2007-09-06
Applicant: 浙江工业大学
IPC: C12N15/63
Abstract: 本发明提供了一种周质分泌融合表达型前T载体，由如下方法制备得到：(1)构建编码BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-HindIII的DNA 1片段；(2)定点突变pET39质粒中LacI基因内部的三个XcmI位点，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39’；(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39’中，得到所述周质分泌融合表达型前T载体。本发明除了使用XcmI制备线形T载体外，不需要用其它限制性内切酶，一步法构建融合表达基因工程菌，为大量制备活性肽工程菌库提供了可行的技术方法。
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公开(公告)号：CN101381738B
公开(公告)日：2012-02-01
申请号：CN200710071213.3
申请日：2007-09-06
Applicant: 浙江工业大学
IPC: C12N15/63
Abstract: 本发明提供了一种胞内融合表达型前T载体，由如下方法制备得到：(1)构建编码BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-HindIII的DNA1片段；(2)定点突变pET39质粒中LacI基因内部的三个XcmI位点，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39-1；(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39-2中；(4)去除pET39-2中DsbA信号肽基因，得到所述胞内融合表达型前T载体。本发明除了使用XcmI制备线形T载体外，不需要用其它限制性内切酶，可一步法构建融合表达基因工程菌，为大量制备活性肽工程菌库提供了可行的技术方法。
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公开(公告)号：CN101333538B
公开(公告)日：2010-12-08
申请号：CN200710069815.5
申请日：2007-06-29
Applicant: 浙江工业大学
Abstract: 本发明提供了一种前T载体，由以下方法制备得到：(1)以含有氨苄青霉素除外的大肠杆菌敏感的抗生素的抗性基因的质粒为模板进行PCR扩增，在引物的5’末端引入XcmI酶切位点，扩增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表达调控序列、两端含有XcmI酶切位点的DNA片段；(2)用T4DNA连接酶将步骤(1)得到的DNA片段和pUCmT载体进行连接；(3)将步骤(2)所得连接产物转化大肠杆菌DH5α或JM109，筛选阳性克隆，即得所述前T载体。本发明的有益效果主要体现在：用本发明前T载体制备得到的载体可用于快速克隆PCR产物，筛选阳性克隆过程中不需要使用X-gal、阴性率低。
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公开(公告)号：CN101381738A
公开(公告)日：2009-03-11
申请号：CN200710071213.3
申请日：2007-09-06
Applicant: 浙江工业大学
IPC: C12N15/63
Abstract: 本发明提供了一种胞内融合表达型前T载体，由如下方法制备得到：(1)构建编码BspTI－GSGSG－HHHHHH－XcmI－Ampr－XcmI－HindIII的DNA1片段；(2)定点突变pET39质粒中LacI基因内部的三个XcmI位点，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39－1；(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39－2中；(4)去除pET39－2中DsbA信号肽基因，得到所述胞内融合表达型前T载体。本发明除了使用XcmI制备线形T载体外，不需要用其它限制性内切酶，可一步法构建融合表达基因工程菌，为大量制备活性肽工程菌库提供了可行的技术方法。
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