公开(公告)号：KR101412038B1

公开(公告)日：2014-07-01

申请号：KR1020120082501

申请日：2012-07-27

Applicant: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)

Inventor： 고영준 ,  이향심 ,  박종현 ,  이광녕 ,  김수미 ,  조인수

IPC: C12N7/01 ,  G01N33/569 ,  C12N15/33 ,  C07K16/08

Abstract: 본 발명은 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법에 관한 것이다.
본 발명의 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법의 일예로서 하기 (1)단계 내지 (11)단계로부터 실시될 수 있다.
(1) 플레이트에 C형 구제역 바이러스 항체를 반응시키는 단계;
(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체를 세척하여 제거하는 단계;
(3) 상기 플레이트에 진단항원으로 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질을 반응시키는 단계;
(4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질을 세척하여 제거하는 단계;
(5) 상기 플레이트에 검사혈청시료를 반응시키는 단계;
(6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 검사혈청시료를 세척하여 제거하는 단계;
(7) 상기 플레이트에 C형 구제역 바이러스 단클론항체를 넣어 반응시키는 단계;
(8) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 단클론항체를 제거하는 단계;
(9) 상기 플레이트에 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항마우스 항체를 반응시키는 단계;
(10) 상기 플레이트에 부착되지 않은 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항마우스 항체를 세척하여 제거하는 단계;
(11) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사혈청시료 중의 C형 구제역 바이러스 항체 수준을 측정하는 단계.

公开(公告)号：KR101384513B1

公开(公告)日：2014-04-14

申请号：KR1020110147110

申请日：2011-12-30

Applicant: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)

Inventor： 이광녕 ,  김수미 ,  박종현 ,  고영준 ,  이향심 ,  조인수 ,  이서용

IPC: C12N15/33 ,  C12N15/86

Abstract: 본 발명은 구제역의 7가지 혈청형(O, A, Asia 1, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3)중에서, O형 PanAsia 계통에 속하는 2002년 국내 발생한 구제역바이러스(O/SKR/2002)의 전체 RNA 게놈을 double strand DNA형태로 증폭하여 벡터에 삽입한 클론들과 그 서열에 관한 것으로서, 이들 클론은 linear DNA형태로 혹은 in vitro transcribed RNA 형태로 특정 세포에 형질도입(Transfection)시켰을 경우에 감염력이 있는 구제역바이러스를 생성하거나 구제역바이러스 단백질을 생산할 수 있도록 최종 선발된 것들이다.
본 발명은 구제역 병원성 확인 연구나 백신 및 진단법 개발의 효과적인 연구 수단으로 폭 넓게 활용될 수 있는 구제역바이러스 cDNA 클론을 작성한 것으로, 클론 작성의 대상이 되는 구제역바이러스는 2002년 국내 양돈농가에서 사육중이던 돼지에서 발생되어 보고된 구제역바이러스 국내분리주 및 임상시료내 바이러스이다. 이 바이러스는 1990년대 초반부터 아시아에서 발생하기 시작하여 현재까지 전 세계적으로 가장 널리 전파된 혈청형 O형의 PanAsia 계통으로 분류되고 있으며, 본 발명에서 이 계통의 바이러스로는 최초로 감염력이 있는 cDNA 형태로 클로닝되었다.
먼저 감염력있는 클론 작성을 위해 돼지유래세포(IB-RS-2)에서 3회 이상 계대증식된 바이러스의 게놈 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 뒤, 전체 게놈을 네 부위로 나누어 증폭시키고 그 각각을 별개의 벡터에 클로닝 하였다. 이렇게 작성된 클론들을 하나의 벡터로 클로닝하여 연결한 뒤, 클로닝 과정에서 임의로 생성된 비의도적 돌연변이를 site-directed mutagenesis를 통하여 원래의 서열과 동일하도록 교정해 주었다. 한편, 분리주 유래의 cDNA 클론에 돼지 및 소 임상시료내 바이러스(야외주) 염기서열을 반영하기 위한 게놈부위(genomic region) 치환 작업을 광범위하게 실시하였다. 이러한 클론들의 세포실험 또는 동물실험을 통해서 우리는 구제역 cDNA클론의 감염성 획득여부에 결정적인 역할을 하는 두 게놈 부위 (poly(C) 및 VP1)를 확인하였고, 이 두 부위에 대한 적절한 유전적 조작(mutagenesis)를 통해서 감염력이 있는 cDNA클론을 최종적으로 선발할 수 있었다. 아울러 감염력은 확인되지 않으나 복제능이 있고 구제역바이러스 단백질을 생산하는 비감염성 cDNA클론도 선발하였다.
특히, VP1 단백질을 번역하는 게놈부위 특정 위치(Residue)의 아미노산서열이 페닐알라닌(Phenylalanine)이 아닌 cDNA클론의 경우, 이 클론은 DNA 혹은 RNA 형태로 세포에 형질도입(Transfection)된 후의 바이러스 생성과정에서 해당 위치의 아미노산서열이 페닐알라닌(Phenylalanine)으로 선택(Selection)되어 치환(Substitution)되는 현상이 지속적으로 확인되었다. 이러한 특정위치의 염기서열(아미노산서열)의 변화는 바이러스가 획득될 때 나타내는 세포변성효과(Cytopathic effect, CPE) 등과 더불어 바이러스 획득여부를 판가름할 수 있는 중요한 지표로 활용될 수 있으며, 바이러스의 침입, 감염 및 진화연구와 바이러스억제제 개발의 소재로도 활용될 수 있다.

公开(公告)号：KR101329348B1

公开(公告)日：2013-11-15

申请号：KR1020120058410

申请日：2012-05-31

Applicant: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)

Inventor： 김수미 ,  박종현 ,  이광녕 ,  고영준 ,  이향심 ,  신연경 ,  김병한

IPC: C12N15/861 ,  C12N15/33 ,  A61K31/7088

CPC classification number: A61K39/12 ,  C07K14/56 ,  C07K14/57 ,  C12N2710/10343 ,  C12N2770/32111 ,  C12N2840/20

Abstract: The present invention relates to a recombinant virus vector having an inhibition effect of foot and mouth disease virus and, more specifically, a recombinant adenovirus enhancing the inhibition effect of foot and mouth disease virus since porcine interferon alpha and porcine interferon gamma are expressed simultaneously through the insertion of foot and mouth virus 2A gene so that the porcine interferon alpha and gamma are able to be treated at once.

Abstract translation: 本发明涉及具有口蹄疫病毒抑制作用的重组病毒载体，更具体而言，增强口蹄疫病毒抑制作用的重组腺病毒，因为猪干扰素α和猪干扰素γ通过 插入口蹄疫病毒2A基因，使得能够立即治疗猪干扰素α和γ。

公开(公告)号：KR1020130114946A

公开(公告)日：2013-10-21

申请号：KR1020120037407

申请日：2012-04-10

Applicant: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)

Inventor： 박종현 ,  김수미 ,  이광녕 ,  초가기 ,  이여주 ,  김은정 ,  고영준 ,  이향심 ,  김병한

IPC: C12N15/63 ,  C12N15/33 ,  C12N7/01

Abstract: PURPOSE: Foot and mouth disease virus expressing defensive protein against foot and mouth disease of O-Cathay topotype is provided to be made into a vaccine, defend against O-Cathy topotype and produce a large amount of antibodies capable of defense within 1-2 weeks by single inoculation. CONSTITUTION: A plasmid has a base sequence like a sequence number 1. In the plasmid, a defensive gene against foot and mouth disease of O-Cathay topotype is inserted. Foot and mouth disease O serotype Cathay structural protein is expressed and produced from the plasmid.

Abstract translation: 目的：提供表达O-Cathay拓扑型口蹄疫防御性蛋白质的口蹄疫病毒，制成疫苗，捍卫O-Cathy拓扑型，并在1-2周内产生大量能够防御的抗体 通过单次接种。 构成：质粒具有序列号1的碱基序列。在质粒中插入了针对O-Cathay拓扑型的口蹄疫的防御基因。 口蹄疫O血清型国泰结构蛋白由质粒表达和产生。

公开(公告)号：KR1020130078265A

公开(公告)日：2013-07-10

申请号：KR1020110147110

申请日：2011-12-30

Applicant: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)

Inventor： 이광녕 ,  김수미 ,  박종현 ,  고영준 ,  이향심 ,  조인수 ,  이서용

IPC: C12N15/33 ,  C12N15/86

Abstract: PURPOSE: A cDNA clone is provided to acquire basic knowledge related to replication, expression, and infection of foot-and-mouth disease virus, and to be used vaccine and diagnostic materials, thereby resolving problems of existing inactivated vaccines. CONSTITUTION: A cDNA clone is prepared using foot-and-mouth disease virus with a base sequence of sequence number 1. The clone is prepared using foot-and-mouth disease virus with a base sequence selected from a group consisted of base sequences of sequence numbers 2, 3, 4, and 5. The clone identifies replication and expression difference of a replicon by manipulating untranslated region (UTR) or T7 promoter site of the clone with a base sequence of sequence number 5. In the clone, G is added at 644nt G and C is substituted with T at 9602nt in T7 promoter. A replicon clone has a base sequence of sequence number 6. [Reference numerals] (AA,BB,CC) Foot-and-mouth disease; (DD) Prepare linear DNA (Nsi cut); (EE) Confirm RNA quantification & integrity; (FF) Confirm virus production; (HH) Acquire infectious foot-and-mouse disease virus or express a non-infectious foot-and-mouth virus-like particle and protein

Abstract translation: 目的：提供cDNA克隆以获得与口蹄疫病毒的复制，表达和感染有关的基础知识，并使用疫苗和诊断材料，从而解决现有灭活疫苗的问题。 构成：使用具有序列号1的碱基序列的口蹄疫病毒制备cDNA克隆。使用口蹄疫病毒制备克隆，碱基序列选自由序列的碱基序列组成的组 编号2,3,4和5.克隆通过用序列号5的碱基序列操纵克隆的非翻译区（UTR）或T7启动子位点来鉴定复制子的复制和表达差异。在克隆中，加入G 在644nt G和C在T7启动子的9602nt被T替代。 复制子克隆具有序列号6的碱基序列。[附图标记]（AA，BB，CC）口蹄疫; （DD）制备线性DNA（Nsi切割）; （EE）确认RNA定量和完整性; （FF）确认病毒生产; （HH）获得感染性脚鼠病毒病毒或表达非感染性口蹄疫病毒样颗粒和蛋白质

公开(公告)号：KR101236203B1

公开(公告)日：2013-02-26

申请号：KR1020100034441

申请日：2010-04-14

Applicant: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)

Inventor： 고영준 ,  이향심 ,  박종현 ,  이광녕 ,  김수미 ,  조인수

IPC: G01N33/569 ,  C07K14/09 ,  C07K16/08 ,  C12N15/40

Abstract: 본 발명은 구제역바이러스 SAT2형 유전자재조합 단백질과 단클론항체를 제작하고 이를 이용하여 구제역 SAT2형 항체를 검출하는 효소결합면역측정법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 진단항원으로서 기존의 불활화바이러스를 유전자재조합 단백질로 대체하여 일반실험실에서 안전하게 제작할 수 있는 형태의 진단항원을 개발하고 구제역바이러스 SAT2형에 대해서 중화역가를 보유한 단클론항체를 제작하여 구제역바이러스 SAT2형 항체를 신속하게 검출하는 새로운 진단방법을 제공함에 있다.
좀 더 상세하게는, 구제역바이러스 SAT2형 구조단백질에 해당하는 P1 유전자와 3C 단백분해효소 유전자를 하나의 발현벡터에 클로닝한 후에 곤충세포에서 발현하여 바이러스유사입자를 제작하고 중화 단클론항체는 바이러스의 중화 에피톱에 해당하는 펩타이드를 합성하여 마우스에 접종한 후 면역세포와 골수종유래 세포를 융합하여 제작하였다. 이렇게 만들어진 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용하여 새로운 형태의 효소결합면역측정법을 개발하였다.
본 발명의 진단방법은 일반실험실에서도 안전하게 생산할 수 있는 유전자재조합 단백질 진단항원을 이용한 경합방식의 효소결합면역측정법으로서 소, 돼지, 염소 등 축종에 상관없이 동일한 방식으로 검사할 수 있으며 구제역바이러스 SAT2형 감염여부를 판정하거나 백신접종시 백신항체역가를 신속하게 측정할 수 있기 때문에 표준검사법인 바이러스중화시험법을 대체할 수 있는 신규 진단법으로의 활용이 가능하다.

公开(公告)号：KR101077188B1

公开(公告)日：2011-10-31

申请号：KR1020080117663

申请日：2008-11-25

Applicant: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)

Inventor： 김수미 ,  박종현 ,  이광녕 ,  고영준 ,  박지용 ,  주이석

IPC: C12N15/86 ,  C12N15/40 ,  C12N15/10 ,  C12N15/09

Abstract: 본발명은구제역바이러스억제및 예방을목적으로특이적으로제작된 siRNA를발현하는재조합아데노바이러스에관한것이다. 보다상세하게는, 우리나라에발생하였던구제역바이러스주(O/SKR/2002)의염기서열을바탕으로비구조단백질부위의특이염기서열을찾고이를디자인한후 아데노클로닝벡터에클로닝하여제조한유전자재조합아데노바이러스에관한것으로서, 이를동물이바이러스에감염되기전에적용하면, 바이러스억제효과를나타내며, 동물이바이러스에감염된이후에적용하더라도바이러스의증식억제효과를나타내어구제역의예방과치료에모두활용할수 있다.

公开(公告)号：KR1020110115006A

公开(公告)日：2011-10-20

申请号：KR1020100034441

申请日：2010-04-14

Applicant: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)

Inventor： 고영준 ,  이향심 ,  박종현 ,  이광녕 ,  김수미 ,  조인수

IPC: G01N33/569 ,  C07K14/09 ,  C07K16/08 ,  C12N15/40

Abstract: 본 발명은 구제역바이러스 SAT2형 유전자재조합 단백질과 단클론항체를 제작하고 이를 이용하여 구제역 SAT2형 항체를 검출하는 효소결합면역측정법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 진단항원으로서 기존의 불활화바이러스를 유전자재조합 단백질로 대체하여 일반실험실에서 안전하게 제작할 수 있는 형태의 진단항원을 개발하고 구제역바이러스 SAT2형에 대해서 중화역가를 보유한 단클론항체를 제작하여 구제역바이러스 SAT2형 항체를 신속하게 검출하는 새로운 진단방법을 제공함에 있다.
좀 더 상세하게는, 구제역바이러스 SAT2형 구조단백질에 해당하는 P1 유전자와 3C 단백분해효소 유전자를 하나의 발현벡터에 클로닝한 후에 곤충세포에서 발현하여 바이러스유사입자를 제작하고 중화 단클론항체는 바이러스의 중화 에피톱에 해당하는 펩타이드를 합성하여 마우스에 접종한 후 면역세포와 골수종유래 세포를 융합하여 제작하였다. 이렇게 만들어진 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용하여 새로운 형태의 효소결합면역측정법을 개발하였다.
본 발명의 진단방법은 일반실험실에서도 안전하게 생산할 수 있는 유전자재조합 단백질 진단항원을 이용한 경합방식의 효소결합면역측정법으로서 소, 돼지, 염소 등 축종에 상관없이 동일한 방식으로 검사할 수 있으며 구제역바이러스 SAT2형 감염여부를 판정하거나 백신접종시 백신항체역가를 신속하게 측정할 수 있기 때문에 표준검사법인 바이러스중화시험법을 대체할 수 있는 신규 진단법으로의 활용이 가능하다.

公开(公告)号：KR100737446B1

公开(公告)日：2007-07-09

申请号：KR1020040096546

申请日：2004-11-23

Applicant: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)

Inventor： 엄재구 ,  박종현 ,  계수정 ,  김용주 ,  이광녕 ,  박지용 ,  조남인

IPC: C12N15/79

Abstract: 본 발명은 구제역바이러스를 구성하는 구조단백질을 코딩하는 유전자와 비구조단백질인 3C 유전자를 적어도 포함하는 재조합베큘로바이러스를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 재조합베큘로바이러스를 숙주세포에 형질전환시켜 구제역바이러스 백신용 항원 및 진단용 항원제시용 재조합단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
베큘로바이러스, 백미드, P1, 3C, 항원

公开(公告)号：KR100536848B1

公开(公告)日：2005-12-19

申请号：KR1020040010973

申请日：2004-02-19

Applicant: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)

Inventor： 엄재구 ,  박종현 ,  계수정 ,  김용주 ,  이광녕 ,  조남인

IPC: C12Q1/68

Abstract: 본 발명은 구제역 바이러스의 비구조단백질에 대한 펩타이드를 항원으로 포함하는 구제역 진단용 키트 및 이를 이용하여 구제역을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 17 및 서열번호 18로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 구제역 바이러스의 비구조단백질 2C 및 3B에 대한 펩타이드를 항원으로 포함하는 구제역 진단용 키트 및 이를 이용하여 발굽이 둘로 갈라진 모든 유제류에 대하여 구제역을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 키트에 포함되는 서열번호 17 및 서열번호 18로 기재되는 펩타이드는 종래의 구제역 진단키트에서 사용되는 재조합 단백질보다 백신 접종축과 감염축에 대한 민감도와 특이도가 뛰어나므로, 구제역감염축 및 백신접종축에 대한 감별 진단에 보다 효과적으로 사용될 수 있다.